一種人尿中檢測香草扁桃酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測領域，尤其是一種人尿中檢測香草扁桃酸的方法。
【背景技術】
[0002] 兒茶酚胺是由腎上腺髓質分泌的一類激素，其中包括了多巴胺、腎上腺素和去腎 上腺素。這些激素往往因為物理或精神上的應激反應，被釋放到血液循環(huán)中，提高大腦神經 沖動傳遞，釋放葡萄糖和脂肪酸以提供能量，支氣管擴張和瞳孔放大。大多數兒茶酚胺會 被代謝降解成為香草扁桃酸（Vanilmandelic acid, VMA)、高香草酸（homovanillic acid, HVA)、變腎上腺素（metanephrine)和去甲腎上腺素（normetanephrine)，只有少量兒茶酚 胺隨尿排出體外。
[0003] VM又名3-甲氧基-4-羥基扁桃酸或4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸，是一種兒茶酚 胺類腎上腺素和去腎上腺素的代謝產物，最終隨尿排出體外。VMA在尿樣中的含量非常穩(wěn) 定，只有發(fā)生應激反應后含量才會略有增加。但是神經母細胞瘤（neuroblastomas)，嗜鉻細 胞瘤（pheochromocytomas)和其他的神經內分泌腫瘤（neuroendocrine tumors)能夠大量 產生兒茶酚胺，引起VMA含量的劇增。由于大量兒茶酚胺進入血液循環(huán)，使血管收縮，末梢 阻力增加，心率加快，血壓出現陣發(fā)性急驟升高。這些病人的臨床表現為持續(xù)性高血壓、心 悸、惡心嘔吐、氣短、胸部壓抑、頭痛、手足發(fā)麻、大量出汗、視力模糊等，嚴重者可能出現腦 溢血或肺水腫等高血壓危象。尿VMA含量過高是兒茶酚胺分泌異常的一個重要標志，是診 斷神經母細胞瘤和嗜鉻細胞瘤的首選標志物。
[0004] 目前VMA的檢測手法主要有比色-色譜聯用技術、ELISA和HPLC法。
[0005] 市售的VM檢測ELISA試劑盒普遍應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定VM水 平。ELISA試劑盒具有靈敏、快速特點，但缺點是穩(wěn)定性不高，對操作人員的技術有較高要 求。而且該類產品主要為國外進口，如Cloud-Clone Corp.(美國）、Biocompare(美國）、 RDG(美國）、Eaglebio (美國）等，價格昂貴。由于抗體等核心技術為國外壟斷，國內尚無 自主研發(fā)產品,無法根本上降低試劑成本。
[0006] 比色-色譜聯用技術，目前國內批準的檢測試劑盒為西班牙Biosystems S. A.生 產的香草扁桃酸分析試劑盒（國食藥監(jiān)械（進）字2010第2402315號），該方法采用陰離 子交換樹脂將尿液中的VM吸附保存在樹脂上，其他干擾物質則不能被保留而清楚，最后 洗脫純化VMA。再在堿性條件下VM被氧化形成香草蘭素，通過紫外分光比色法進行定量分 析。該方法效率高，檢測性好，缺點是該試劑盒為國外壟斷產品，價格昂貴。
[0007] HPLC技術檢測VMA被認為最有前途的VMA檢測方法。其中電化學檢測法的研究相 當成熟，此外化學后修飾法（Taran)、色譜質譜聯用技術（Fay ler、Lionetto)和毛細管電 泳技術檢測法也紛紛建立。這些方法優(yōu)點是靈敏度高、檢測速度快，但是需要特殊儀器，價 格昂貴，成本高，操作人員需要特別培訓，難以廣泛應用于臨床。HPLC聯合UV檢測法鮮有報 道，而UV檢測器成本低，一般購置HPLC的同時都會配備UV檢測器。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明要解決上述現有技術的缺點，提供一種快速、高效、廉價的人尿中檢測香草 扁桃酸的方法。
[0009] 本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案：這種人尿中檢測香草扁桃酸的方法，其 步驟包括：
[0010] 1)取人尿液用HCl酸化，在-80°C條件下保存，尿液融化后用乙酸乙酯萃取、揮發(fā)， 醋酸再溶解，可獲得VM粗提取物；
[0011] 2)上述粗提取物經過HPLC分離，在UV檢測器280nm波長下，獲得穩(wěn)定單一的VMA 吸收峰，并通過外標法繪制VM標準曲線，最終計算出VM的含量。
[0012] 作為優(yōu)選，其中步驟1)具體如下：
[0013] a)收取新鮮尿液后，加入5M HCl酸化，放入-80°c冷柜中保存，直到開始后續(xù)實 驗；
[0014] b)待尿液融化后,取4ml尿液到一個預裝有2g NaCl的15ml離心管內，上下顛倒 混合IOmin形成飽和鹽溶液；
[0015] c)加入4ml乙酸乙酯，上下顛倒混合5min ;4000g離心5min，小心吸取上層有機相 到一根新50ml圓底離心管內；
[0016] d)重復b-c步2次，獲得上層有機相共12ml ;
[0017] e)將離心管用金屬加熱器加熱到45°C，在通風柜內高風揮發(fā)，直到所有的乙酸乙 酯揮發(fā)完全，獲得黃色或黑色沉淀；
[0018] f)加入400 μ 11 %醋酸溶液，充分震蕩，4°C過夜溶解；
[0019] g) 15000g離心后，將上清液移到新1.5ml離心管內，4°C保存不超過1周，等待 HPLC檢測。
[0020] 作為優(yōu)選，其中HPLC條件為：
[0021] 柱子：SP-C18 (4. 6mm*250mm, 5um);
[0022] 流動相：A(水：醋酸=98 : I) :B(水：甲醇：醋酸=68 : 30 : 2)梯度洗脫；
[0023] 洗脫梯度：0-15min :100% A-20% A
[0024] 15-20min ：20% A
[0025] 20-21min ：20% A-100% A
[0026] 21-35min :100% A
[0027] 流速：0· 8ml / min ;
[0028] 檢測波長：UV280nm ;
[0029] 上樣量：100 μ 1。
[0030] 作為優(yōu)選，外標法繪制VM標準曲線步驟如下：用電子分析天平稱取VMA，用1%的 醋酸配置成 Ing / μ 1、2· 5ng / μ l、5ng / μ l、10ng/y l、20ng/y lUOOng/μ 1 的濃度梯 度的VMA溶液，將這些濃度梯度的VMA溶液先后上HPLC柱檢測，并根據其檢測結果繪制標 準曲線。
[0031] 發(fā)明有益的效果是：本發(fā)明成本低，操作簡便，提供了一種快速、低廉、靈敏的人尿 中檢測VMA的方法。
【附圖說明】
[0032] 圖1是20ng / μ 1的VMA上樣后的HPLC峰圖；
[0033] 圖2是VMA標準曲線圖；
[0034] 圖3是實施例1中的VM檢測圖；
[0035] 圖4是實施例2中的VM檢測圖；
【具體實施方式】
[0036] 下面結合附圖對本發(fā)明作進一步說明：
[0037] 參照附圖：
[0038] 本發(fā)明的這種人尿VM的檢測方法包括以下步驟：
[0039] I) VMA粗提取物的制備
[0040] a)收取新鮮尿液后，加入5Μ HCl酸化，放入-80°c冷柜中保存，直到開始后續(xù)實 驗；
[0041] b)待尿液融化后,取4ml尿液到一個預裝有2g NaCl的15ml離心管內，上下顛倒 混合IOmin形成飽和鹽溶液；
[0042] c)加入4ml乙酸乙酯，上下顛倒混合5min ;4000g離心5min，小心吸取上層有機相 到一根新50ml圓底離心管內；
[0043] d)重復b-c步2次，獲得上層有機相共12ml ;
[0044] e)將離心管用金屬加熱器加熱到45°C，在通風柜內高風揮發(fā)，直到所有的乙酸乙 酯揮發(fā)完全，獲得黃色或黑色沉淀；
[0045] f)加入400 μ 11 %醋酸溶液，充分震蕩，4°C過夜溶解；
[0046] g) 15000g離心后，將上清液移到新1.5ml離心管內，4°C保存不超過1周，等待 HPLC檢測。
[0047] 2)上述粗提取物經過HPLC分離，在UV檢測器280nm波長下，獲得穩(wěn)定單一的VMA 吸收峰，并通過外標法繪制VM標準曲線，最終計算出VM的含量。
[0048] 其中HPLC條件為：
[0049] 柱子：SP-C18 (4. 6mm*250mm, 5um);
[0050] 流動相：A(水：醋酸=98 : I) :B(水：甲醇：醋酸=68 : 30 : 2)梯度洗脫；
[0051] 洗脫梯度：0-15min : 100% A-20% A
[0052] 15-20min ：20% A
[0053] 20-21min ：20% A-100% A
[0054] 21-35min ：100% A
[0055] 流速：0· 8ml / min ;
[0056] 檢測波長：UV280nm ;
[0057] 上樣量：100 μ 1。
[0058] VM標準曲線繪制方法：用電子分析天平稱取VM (Sigma，Η0131)，用1%的醋酸配 置成 lng/μ 1、2· 5ng/y l、5ng / μ UlOng/μ l、20ng / μ lUOOng/μ 1 的濃度梯度的 VMA 溶液，將這些濃度梯度的VMA溶液先后上HPLC柱檢測。
[0059] 20ng / μ 1的VMA上樣后的HPLC峰圖如圖1所示。VMA峰出現在11. 0-11. 5min。
[0060] 不同濃度VMA的檢測結果如下：
[0061]
【主權項】
1. 一種人尿中檢測香草扁桃酸的方法，其步驟包括： 1) 取人尿液用HCl酸化，在-80°C條件下保存，尿液融化后用乙酸乙酯萃取、揮發(fā)，醋酸 再溶解，可獲得VMA粗提取物； 2) 上述粗提取物經過HPLC分離，在UV檢測器280nm波長下，獲得穩(wěn)定單一的VMA吸收 峰，并通過外標法繪制VM標準曲線，最終計算出VM的含量。
2. 根據權利要求1所述的人尿中檢測香草扁桃酸的方法，其特征是：步驟1)具體如 下： a) 收取新鮮尿液后，加入5M HCl酸化，放入-80°C冷柜中保存，直到開始后續(xù)實驗； b) 待尿液融化后,取4ml尿液到一個預裝有2g NaCl的15ml離心管內，上下顛倒混合 IOmin形成飽和鹽溶液； c) 加入4ml乙酸乙酯，上下顛倒混合5min ;4000g離心5min，小心吸取上層有機相到一 根新50ml圓底離心管內； d) 重復b-c步2次，獲得上層有機相共12ml ; e) 將離心管用金屬加熱器加熱到45°C，在通風柜內高風揮發(fā)，直到所有的乙酸乙酯揮 發(fā)完全，獲得黃色或黑色沉淀； f) 加入4001111%醋酸溶液，充分震蕩，4°C過夜溶解； g) 15000g離心后，將上清液移到新I. 5ml離心管內，4°C保存不超過1周，等待HPLC檢 測。
3. 根據權利要求1所述的人尿中檢測香草扁桃酸的方法，其特征是：HPLC條件為： 柱子：SP_C18(4. 6mm*250mm，5um); 流動相：A(水：醋酸=98 : I) :B(水：甲醇：醋酸=68 : 30 : 2)梯度洗脫； 洗脫梯度：〇-15min :100% A-20% A 15-20min ：20% A 20- 21min ：20% A-100% A 21- 35min ：100% A 流速：〇. 8ml / min ; 檢測波長：UV280nm ; 上樣量：100 yl。
4. 根據權利要求1所述的人尿中檢測香草扁桃酸的方法，其特征是：外標法繪制VM 標準曲線步驟如下：用電子分析天平稱取VMA，用1%的醋酸配置成Ing / iU、2. 5ng/iil、 5ng/ia、10ng/iil、20ng / iUUOOng/iil的濃度梯度的VMA溶液，將這些濃度梯度的VMA 溶液先后上HPLC柱檢測，并根據其檢測結果繪制標準曲線。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人尿中檢測香草扁桃酸的方法。取人尿液用HCl酸化防腐，可在-80oC條件下長期保存；尿液用乙酸乙酯萃取、揮發(fā)、醋酸再溶解等工序，可獲得VMA粗提取物。該粗提物經過HPLC分離，可在UV檢測器280nm波長下，獲得穩(wěn)定單一的VMA吸收峰，并可通過外標法繪制VMA標準曲線，最終計算出VMA的含量。該方法成本低，操作簡便，提供了一種快速、低廉、靈敏的人尿中檢測VMA的方法。
【IPC分類】G01N30-88, G01N30-06
【公開號】CN104807923
【申請?zhí)枴緾N201410034795
【發(fā)明人】劉軍, 陳齊, 謝丹
【申請人】杭州紐貝生物科技有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年1月23日