一種快速測定山羊乳腺上皮細胞脂肪酸成分的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物樣品分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速測定山羊乳腺上皮細胞脂 肪酸成分的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺是哺乳動物中少數(shù)可以重復(fù)經(jīng)歷生長，功能分化和退化過程的器官之一，也 是動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及乳腺生物反應(yīng)器等研宄的重要組織，因此明確乳腺的生物學功能具有 重要意義。乳腺上皮細胞是乳腺組織的重要組成部分，對于研宄乳腺的功能具有重要價值， 已成為研宄乳腺功能的重要靶細胞之一。通過測定細胞內(nèi)脂肪酸成分的變化從而探討細胞 中脂代謝調(diào)控機制是現(xiàn)在研宄乳腺的功能的重要手段，其生成的脂肪酸是乳中脂肪酸的重 要來源，同時，細胞內(nèi)脂肪酸成分也是細胞內(nèi)重要的信號分子，通過測定細胞中脂肪酸的成 分的變化來探討脂肪酸在乳腺內(nèi)脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用具有重要意義。
[0003] 然而，現(xiàn)在對于脂肪酸提取及測定的報道主要集中在組織及乳中，組織中脂肪酸 的測定主要應(yīng)用氯仿/甲醇/水系統(tǒng)，然而這種方法毒性較強，且過程較為繁瑣，耗時較長。 對于細胞中脂肪酸的提取及測定報道較少，所以獲得一種適用于山羊乳腺上皮細胞中脂肪 酸成分的提取及測定分析方法尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種適用于山羊乳 腺上皮細胞中脂肪酸成分的提取及測定分析方法。
[0005] 本發(fā)明提供的一種快速測定山羊乳腺上皮細胞脂肪酸成分的方法，包括以下步 驟：
[0006] Al :收集細胞
[0007] 待細胞培養(yǎng)皿中細胞密度為90%以上時棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗細 胞，然后向所述細胞培養(yǎng)皿中添加一定量的硫酸/甲醇溶液，然后用細胞刮鏟將細胞完全 轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入一定量的硫酸/甲醇溶液的微量玻璃反應(yīng)瓶中；所述細胞指山羊乳腺上皮 細胞。用刮取的方法盡可能多的保留了樣品內(nèi)的脂肪酸成分，采用微量玻璃反應(yīng)瓶則避免 了酯化過程中的泄露情況的發(fā)生。
[0008] A2:甲酯化處理
[0009] 將所述微量玻璃反應(yīng)瓶蓋擰緊密封，然后進行超聲處理，超聲處理后于水浴中放 置一定時間，然后于室溫下自然冷卻。
[0010] A3 :脂肪酸抽提
[0011] 待冷卻至室溫后向所述微量玻璃反應(yīng)瓶中加入I. 5mL~2. 5mL0.1 M的HCl水 溶液，并使用硅化槍頭向微量玻璃反應(yīng)瓶中加入800 yL~I. 5mL正己烷，然后渦旋震蕩 30s~Imin震蕩后離心。所述加入800~I. 5mL正己燒用較小的容積盡量增大樣品的濃 度，同時避免了加入量過大時，后續(xù)濃縮過程中造成脂肪酸成分損失而影響測定結(jié)果。
[0012] A4:成分測定
[0013] 使用硅化槍頭取離心所得上清液并加入至裝有無水似2504的2mL硅化離心管中， 然后震蕩30s~Imin后靜置5~7min，靜置后離心，吸取離心所得上清液并加入至玻璃進 樣瓶中用于GC-MS分析。
[0014] 進一步的，上述步驟Al中，所述細胞培養(yǎng)皿的規(guī)格為60mm~100mm，所述一定量的 硫酸/甲醇溶液是指500 μ L~I. 5mL2. 5 %硫酸/甲醇溶液；所述2. 5 %硫酸/甲醇溶液指 含硫酸體積百分比為2. 5%的甲醇溶液。
[0015] 進一步的，上述步驟A2中，所述超聲處理的時間為10~20min，所述水浴指80°C 水浴，所述一定時間為60min。
[0016] 進一步的，上述步驟A3中，向所述微量玻璃反應(yīng)瓶中加入2mL0.1 M的HCl水溶液。
[0017] 進一步的，上述步驟A3中，離心的條件為：3000r/min離心5min。
[0018] 進一步的，上述GC-MS分析的條件如下：
[0019] 載氣：He ;
[0020] 載氣流速：lmL/min ;
[0021] 進樣 口溫度：240 °C;
[0022] 進樣量：1 μ L ;
[0023] 分流比：1:10;
[0024] 升溫程序：40°C保持2min，然后以8°C /min升溫至180°C并保持2min，然后以3°C / min升溫至240°C并保持IOmin ;
[0025] 質(zhì)譜溶劑延遲：5min ;
[0026] 電離能：70eV ;
[0027] 質(zhì)量數(shù)范圍：35~500amu。
[0028] 通過與現(xiàn)有技術(shù)進行對比分析，本發(fā)明的有益效果在于：步驟A1，使用了細胞刮 板代替?zhèn)鹘y(tǒng)的胰酶消化法；使用8mL的微量玻璃反應(yīng)管代替了常用玻璃管，保證了反應(yīng)過 程的密封性和安全性，常用的玻璃管易漏氣，而且有爆裂的危險；步驟A2,使用0.25%硫 酸/甲醇溶液代替了常用的氫氧化鉀/甲醇溶液；使用基于超聲波清洗機的超聲波裂解法 裂解細胞；硫酸/甲醇溶液能夠很好的使游離的脂肪酸和結(jié)合態(tài)的脂肪酸都能夠甲酯化， 而氫氧化鉀/甲醇溶液僅適用于游離態(tài)的脂肪酸，對于結(jié)合態(tài)的脂肪酸的甲酯化效果不 佳。使用超聲波清洗機可以在密封的環(huán)境下進行，如果使用傳統(tǒng)的超聲波破碎儀，在開放 的環(huán)境下則可能導(dǎo)致脂肪酸成分的揮發(fā)；步驟A3,使用I. 5mL~2. 5mL0.1 M的HCl溶液和 800 μ L~I. 5mL正己烷進行脂肪酸甲酯的提取；添加 HCl能夠保證溶液的酸性條件，有益 于保證脂肪酸成分的真實性，避免了使用水對酸性環(huán)境的改變。同時800 μ L~I. 5mL的 添加量可保證溶液的成功分層，又可以最大限度的減少因為過程的繁瑣而導(dǎo)致的成分的損 失；本發(fā)明在收集細胞后直接進行破碎并甲酯化，然后再進行脂肪酸的提取，全過程只使用 一次水相與有機相的分離，較傳統(tǒng)的脂質(zhì)提取方法具有簡單，快速，準確的優(yōu)點，且適合于 批量處理。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明山羊乳腺上皮細胞脂肪酸測定的GC-MS圖。
【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明提供的一種快速測定山羊乳腺上皮細胞脂肪酸成分的方法，包括以下步 驟：
[0031] Al :收集細胞
[0032] 待細胞培養(yǎng)皿中細胞密度為90%以上時棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗細 胞，然后向所述細胞培養(yǎng)皿中添加一定量的硫酸/甲醇溶液，然后用細胞刮鏟將細胞完全 轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入一定量的硫酸/甲醇溶液的微量玻璃反應(yīng)瓶中；所述細胞指山羊乳腺上皮 細胞。用刮取的方法盡可能多的保留了樣品內(nèi)的脂肪酸成分，采用微量玻璃反應(yīng)瓶則避免 了酯化過程中的泄露情況的發(fā)生。
[0033] A2:甲酯化處理
[0034] 將所述微量玻璃反應(yīng)瓶蓋擰緊密封，然后進行超聲處理，超聲處理后于水浴中放 置一定時間，然后于室溫下自然冷卻。
[0035] A3 :脂肪酸抽提
[0036] 待冷卻至室溫后向所述微量玻璃反應(yīng)瓶中加入I. 5mL~2. 5mL0.1 M的HCl水 溶液，并使用硅化槍頭向微量玻璃反應(yīng)瓶中加入800 yL~I. 5mL正己烷，然后渦旋震蕩 30s~Imin震蕩后離心。所述加入800~I. 5mL正己燒用較小的容積盡量增大樣品的濃 度，同時避免了加入量過大時，后續(xù)濃縮過程中造成脂肪酸成分損失而影響測定結(jié)果。
[0037] A4 :成分測定
[0038] 使用硅化槍頭取離心所得上清液并加入至裝有無水Na2SOd^ 2mL硅化離心管中， 然后震蕩30s~Imin后靜置5~7min，靜置后離心，吸取離心所得上清液并加入至玻璃進 樣瓶中用于GC-MS分析。
[0039] 進一步的，上述步驟Al中，所述細胞培養(yǎng)皿的規(guī)格為60mm~100mm，所述一定量的 硫酸/甲醇溶液是指500 μ L~I. 5mL2. 5 %硫酸/甲醇溶液；所述2. 5 %硫酸/甲醇溶液指 含硫酸體積百分比為2. 5%的甲醇溶液。
[0040] 進一步的，上述步驟A2中，所述超聲處理的時間為10~20min，所述水浴指80°C 水浴，所述一定時間為60min。
[0041] 進一步的，上述步驟A3中，向所述微量玻璃反應(yīng)瓶中加入2mL0.1 M的HCl水溶液。
[0042] 進一步的，上述步驟A3中，離心的條件為：3000r/min離心5min。
[0043] 進一步的，上述GC-MS分析的條件