一種檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素抗體的阻斷ELISA方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物抗體檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素抗體 的ELISA方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，C. perfringens)是一種重要的人畜共 患病病原體，廣泛分布于自然界，導(dǎo)致多種動(dòng)物發(fā)生壞死性腸炎（Necrotic enteritis，NE) 和腸毒血癥以及人類的氣性壞疽和食物中毒。產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的多種毒素在其引發(fā)的疾 病中具有重要作用。
[0003] 近二十年來(lái)，α毒素被認(rèn)定是養(yǎng)禽業(yè)壞死性腸炎的主要致病因素，A型 C. perfringens的培養(yǎng)上清能夠使肉雞出現(xiàn)壞死性病變，而且抗α毒素抗體具有保護(hù)作 用。但近期關(guān)于NetB毒素 （Necrotic enteritis B-Iike toxin)的研宄對(duì)該病的致病機(jī) 制又增加了新的解釋。NetB毒素是首次在NE病雞體內(nèi)分離的A型C. perfringens中發(fā)現(xiàn) 的。從雞壞死性腸炎患病動(dòng)物體內(nèi)分離的大量菌株攜帶NetB基因，動(dòng)物疾病模型出現(xiàn)的大 體病變與臨床報(bào)道的壞死性腸炎病變相同。因此，認(rèn)為NetB在禽類壞死性腸炎的發(fā)病機(jī)制 中可能是一種關(guān)鍵和重要的致病毒力因子。阻斷ELISA方法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌血清中是 否含有NetB毒素是至關(guān)重要的。因此NetB毒素的檢測(cè)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷具有重要 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素抗體的阻斷ELISA方法，用 于NetB毒素的早期檢測(cè)，為產(chǎn)氣莢膜梭菌的早期診斷和綜合防治及后續(xù)科學(xué)研宄提供有 效檢測(cè)工具。此方法只需要少量的血清樣品，對(duì)于疾病的檢測(cè)更加便捷。
[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素抗體的阻斷ELISA方法，包括如下步驟：
[0007] 一、阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立
[0008] (1)用包被液將產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素重組蛋白稀釋至5 μ g/mL，100 μ L/孔包被 96孔酶標(biāo)板，4 °C過(guò)夜；
[0009] (2) PBST溶液洗滌3次，加入用PBS溶液稀釋的1 % BSA作為封閉液200 μ L/孔， 37°C孵育 2h ;
[0010] ⑶PBST溶液洗滌3次后加入待檢樣品，同時(shí)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為 NetB毒素多克隆抗體，陰性對(duì)照為陰性血清，100 μ L/孔，37°C孵育I. 5h ;
[0011] (4) 3次PBST溶液洗滌后，將抗產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素的F9G3單克隆抗體用PBS 緩沖液稀釋至〇. 635 μ g/mL，100 μ L/孔，37°C反應(yīng)Ih ;
[0012] (5) PBST溶液洗滌3次，加入用PBS緩沖液I : 5000體積比稀釋的HRP標(biāo)記的羊 抗鼠 IgG抗體，37°C孵育lh，PBST溶液洗滌3次；
[0013] (6)最后加入顯色液100 μ L/孔，室溫條件避光反應(yīng)lOmin，用2M &504溶液終止 反應(yīng)，490?處讀取吸光值。
[0014] 二、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
[0015] 計(jì)算CP陰性樣品平均值（I)與標(biāo)準(zhǔn)差（S)，求得（I )+3( S )為陽(yáng)性臨界值， (1)+2(3)為陰性臨界值；當(dāng)樣品阻斷率 ？12:(；0+3(3)，則血清樣品判為陽(yáng)性；當(dāng) PI沒(méi)i )+2( S )時(shí)為陰性；對(duì)于在介于兩者之間的血清樣品，判定為可疑，需要重復(fù)檢測(cè)一 次，如仍可疑則判定為陽(yáng)性。
[0016] 本發(fā)明中，所述包被液為0. 05mol/L碳酸鹽包被緩沖液，其配制方法如下：稱取 Na2CO3 1.5g、NaHC03 2.93g，調(diào)節(jié) pH 至 9.6，加蒸餾水至100〇11^，4°〇保存。
[0017] 本發(fā)明中，所述PBST溶液為含0. 05% Tween-20的PBS溶液，其配制方法為：稱取 NaCl 8g，KCl 0· 2g，Na2HPO4 · 12H20 3. 58g，KH2PO4 0· 27g，加蒸餾水至 lOOOmL，調(diào)至 ρΗ7· 4 ; 再加入 〇· 5mL Tween-20 〇
[0018] 本發(fā)明中，所述封閉液為PBS溶液稀釋的I % BSA，配制方法為：每100ml PBS溶液 中加 Ig BSA。
[0019] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] 1、本發(fā)明在利用單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了一種快速、敏感、特異的阻斷ELISA 方法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌血清中的NetB毒素特異性抗體。
[0021] 2、本方法有望成為臨床產(chǎn)氣莢膜梭菌病的快速診斷及免疫檢測(cè)的重要工具，在產(chǎn) 氣莢膜梭菌疾病的診斷和防治中發(fā)揮重要作用，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
[0022] 3、本發(fā)明確定了最佳抗原的包被量、抗體的稀釋度、抗原的包被時(shí)間、最佳封閉液 和封閉時(shí)間、最佳樣品孵育時(shí)間、最佳單抗的孵育時(shí)間、酶標(biāo)抗體的濃度和作用時(shí)間、最佳 顯色時(shí)間等條件。通過(guò)陰性樣品確定了臨界值，最低抗原檢出量確定了其靈敏性，特異性試 驗(yàn)確定了其特異性良好，批內(nèi)批間試驗(yàn)確定該方法的重復(fù)性良好。
[0023] 4、本發(fā)明只需要少量的血清樣品，應(yīng)用建立的NetB毒素阻斷ELISA檢測(cè)方法可以 對(duì)疾病進(jìn)行更加便捷的檢測(cè)。
[0024] 5、本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、可定量檢測(cè)和大批量檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1是產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素重組蛋白表達(dá)，1 :空載體，2 :marker，3 :0小時(shí)對(duì) 照，4 :1小時(shí)，5 :2小時(shí)，6 :3小時(shí)，7 :4小時(shí)，8 :5小時(shí)，9 :上清，10 :沉淀；
[0026] 圖2是F9G3株單克隆抗體腹水純化，0 :純化前，1 :純化后，2 !Marker ;
[0027] 圖3是三因素法確定的最佳蛋白、多抗和單抗?jié)舛龋?br>[0028] 圖4是抗原包被時(shí)間的選擇；
[0029] 圖5是最佳封閉液的選擇；
[0030] 圖6是最佳封閉時(shí)間的選擇；
[0031] 圖7是最佳待檢樣品孵育時(shí)間的選擇；
[0032] 圖8是最佳單抗孵育時(shí)間的選擇；
[0033] 圖9是最佳酶標(biāo)抗體稀釋濃度的選擇；
[0034] 圖10是最佳酶標(biāo)抗體孵育時(shí)間的選擇；
[0035] 圖11是最佳顯色液作用時(shí)間的選擇；
[0036] 圖12是阻斷ELISA特異性試驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此，凡是對(duì)本 發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：
[0040] 將PCR鑒定pGEX-NetB陽(yáng)性的重組表達(dá)菌按1 : 100 (v/v)接種于20mLAmp+LB液 體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)2-3h。當(dāng)培養(yǎng)物的0D_值達(dá)0. 4-0. 6時(shí)，取出ImL菌液作為 誘導(dǎo)前（Oh)對(duì)照，置于4°C暫時(shí)保存。向剩余菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmmol/L， 繼續(xù)培養(yǎng)。每隔Ih (即誘導(dǎo)后第1、2、3、4和5h)取出ImL菌液。將各小時(shí)菌液進(jìn)行1000 Or/ min離心5min收集細(xì)菌沉淀，加入20 μ L PBS懸起沉淀后加入等量2 X SDS上樣緩沖液（含 200mmol/L DTT)混勻，煮沸10min，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析重組蛋白的 表達(dá)情況。根據(jù)預(yù)測(cè)的重組蛋白分子量大小選擇使用濃度為12 %的分離膠和5 %的壓縮膠 進(jìn)行SDS-PAGE分析（見(jiàn)圖1)，經(jīng)切膠純化復(fù)性制備的NetB毒素重組蛋白（見(jiàn)圖2);蛋白 質(zhì)印跡法（Western-blot)驗(yàn)證純化后的NetB毒素重組蛋白的純度和免疫原性，用于后續(xù) 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
[0041] 實(shí)施例2
[0042] 抗產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素多克隆抗體的制備：
[0043] 選取2_3Kg新西蘭大白兔，首免為純化的NetB毒素重組蛋白與等體積弗式完全佐 劑完全乳化后背部皮下多點(diǎn)注射，劑量為2mg/只，首免2周后用弗式不完全佐劑與等體積 純化的NetB毒素重組蛋白完全乳化，劑量為Img/只，每周免疫1次，3免后1周用不加佐劑 的純化的NetB毒素重組蛋白加強(qiáng)免疫1次，7d后兔心臟采血獲得血清，得到抗產(chǎn)氣莢膜梭 菌NetB毒素多克隆抗體，通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，蛋白質(zhì)印跡法用于多抗特性鑒 定。
[0044] 實(shí)施例3
[0045] 抗產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素單克隆抗體的制備：
[0046] a、產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素重組蛋白免疫BALB/c小鼠
[0047] 選擇與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0同源的純系雌性BALB/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以純化和復(fù) 性后的NetB毒素重組蛋白為免疫抗原，首次免疫時(shí)取50 μ g純化蛋白與等體積完全弗氏佐 劑進(jìn)行乳化，采用腹腔注射方式對(duì)6周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫；3周后取50 μ g純化 蛋白與等體積不完全弗氏佐劑乳化進(jìn)行第二次免疫；此后每隔2周進(jìn)行一次免疫，免疫劑 量和免疫途徑與第二次免疫相同，最后一次免疫后3-