一種檢測(cè)蔬果中赭曲霉毒素a的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于痕量分析技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種檢測(cè)、分析蔬果中赭曲霉毒素A的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬等產(chǎn)毒菌株參數(shù)的一組結(jié)構(gòu)類似的有毒代謝產(chǎn)物， 廣泛存在于各種食品、飼料及農(nóng)產(chǎn)品中。赭曲霉毒素包括7種有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，其 中赭曲霉毒素A在自然界中分布最廣泛，毒性最強(qiáng)，對(duì)人類和動(dòng)植物影響最大。毒理學(xué)研宄 表明，赭曲霉毒素A具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、以及致畸和致突變作用等多種毒 性，對(duì)動(dòng)物和人體健康有很大的潛在危害。因此世界各國(guó)均重視對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)和 控制，制定了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，以便于確保食品安全和消除國(guó)際貿(mào)易中的技術(shù)壁皇。目前常用 的赭曲霉毒素A檢測(cè)方法有薄層色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE)、酶聯(lián)免疫吸附 法（ELISA)等。這些常用的檢測(cè)方法對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)起著非常重要的作用，但是 這些方法或多或少存在一些缺陷如：樣品前處理復(fù)雜、適用性差不強(qiáng)、靈敏度低、重現(xiàn)性差 等問(wèn)題，而且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及檢測(cè)水平的提高，對(duì)食品中的赭曲霉毒素A限量標(biāo) 準(zhǔn)的要求也在不斷地提高，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已不能滿足現(xiàn)在的檢測(cè)需求。因此建立一種快 速、高通量、高靈敏度、成本低、特異性好的檢測(cè)方法，從而對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中存在的真菌毒素進(jìn)行 有效監(jiān)控十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有檢測(cè)蔬果中赭曲霉毒素A存在的樣品前處理效果差、適用性差不 強(qiáng)、靈敏度低、重現(xiàn)性差等問(wèn)題，提供了一種以乙腈和四氫呋喃混合液作為萃取劑，結(jié)合液 相色譜儀熒光檢測(cè)器進(jìn)行赭曲霉毒素A檢測(cè)的方法。
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)蔬果中赭曲霉毒素A的方法。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種檢測(cè)蔬果中赭曲霉毒素A的方法，包括以下步驟： 1) 樣品前處理：取蔬果樣品碾碎，加入萃取劑，混勻，采用超聲波快速萃取30~60min， 萃取溫度為30~40°C，離心，取上清，將上清過(guò)赭曲霉毒素A免疫親和柱純化，依次用真菌 毒素清洗緩沖液、水淋洗免疫親和柱，然后用甲醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液過(guò)濾，取濾液 得到待測(cè)樣品溶液； 所述萃取劑為乙腈和四氫呋喃的混合液； 2) 建立赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)曲線； 3) 用液相色譜儀熒光檢測(cè)器檢測(cè)樣品溶液，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程計(jì)算得到待測(cè)樣 品溶液中赭曲霉毒素A的濃度，進(jìn)而計(jì)算得出樣品中赭曲霉毒素A的含量。
[0006] 進(jìn)一步的，上述步驟1)中萃取劑的用量為使蔬果樣品濃度為0. 4~0. 6g/ml。
[0007] 進(jìn)一步的，上述萃取劑為乙腈和四氫呋喃按體積比（0. 8~1. 2) :(0. 8~1. 2)混 合的混合液。
[0008] 進(jìn)一步的，上述萃取劑為乙腈和四氫呋喃按體積比1 :1混合的混合液。
[0009] 進(jìn)一步的，步驟1)中所述離心為1800~2200r/min離心8~12min。
[0010] 進(jìn)一步的，步驟1)中所述真菌毒素清洗緩沖液中含有25g/L氯化鈉、5g/L碳酸氫 鈉、0. 01%v/v吐溫20,余量為水。
[0011] 進(jìn)一步的，步驟1)中所述免疫親和柱純化時(shí)的流速為1滴/s。
[0012] 進(jìn)一步的，步驟1)中所述淋洗時(shí)的流速為1滴/s。
[0013] 進(jìn)一步的，步驟1)中所述過(guò)濾的具體操作為：將洗脫液經(jīng)0. 22ym有機(jī)相濾膜過(guò) 濾。
[0014] 進(jìn)一步的，上述液相色譜儀熒光檢測(cè)器檢測(cè)為高效液相色譜儀熒光檢測(cè)器檢測(cè)， 檢測(cè)時(shí)的條件如下： a) 色譜柱：cl8 柱 5ym，150mmX4. 6mm; b) 流動(dòng)相：為乙腈、水、冰乙酸按體積比為49. 5:49. 5:1的混合液； c) 柱流速：0. 9mL/min; d) 柱溫：35°C; e) 進(jìn)樣量：10yL; f) 檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)333nm，發(fā)射波長(zhǎng)477nm。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的檢測(cè)方法前處理過(guò)程采用乙腈、四氫呋喃萃取，再以超聲波、離心進(jìn)行提取 的方式，極大的提高了萃取效率，降低了樣品的基質(zhì)效應(yīng)，而且適用性強(qiáng)，適用于多種蔬菜 中赭曲霉毒素A的測(cè)定。用赭曲霉毒素A免疫親和柱進(jìn)行凈化，操作簡(jiǎn)單，凈化效果好； 同時(shí)用基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)方法的回收率和檢出限進(jìn)行評(píng)價(jià)，證明方法的檢出限低，可達(dá) 0. 0377yg/kg，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高；本申請(qǐng)的方法適用于多種蔬菜中赭曲霉毒素A的測(cè) 定，該色譜技術(shù)花費(fèi)低，分離效果及色譜重現(xiàn)性好，可用于復(fù)雜基體中痕量組的赭曲霉毒素 A定量快速測(cè)定，結(jié)果更加準(zhǔn)確，更有利于目前市場(chǎng)的發(fā)展與推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是赭曲霉毒素A濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖； 圖2是赭曲霉毒素A色譜圖； 圖3是赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0018] 實(shí)施例1萃取劑的優(yōu)化 在對(duì)萃取劑進(jìn)行優(yōu)化之前，本實(shí)施例對(duì)是赭曲霉毒素A濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn) 行了色譜檢測(cè)，色譜檢測(cè)圖如圖1所示；以及赭曲霉毒素A的色譜圖如圖2所示，所得色譜 曲線圖作為后續(xù)赭曲霉毒素A檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照。
[0019] 為了得到更優(yōu)提取效率的溶劑比例，對(duì)萃取劑中各成分間的配比進(jìn)行優(yōu)化，本發(fā) 明方法選用的萃取劑為乙腈和四氫呋喃的混合液，分別設(shè)置乙腈和四氫呋喃體積比例為 1:4、1:3、1:2、1:1、2 :1、3:1作為萃取劑，對(duì)同一蔬菜樣品中赭曲霉毒素4進(jìn)行萃取、檢測(cè)， 每組重復(fù)5次，具體操作如下所述。
[0020] 稱取已知赭曲霉毒素A濃度的10.OOOOg左右蔬菜樣品若干份，分別加入乙腈和四 氫呋喃體積比1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1的混合液作為萃取劑，定容后經(jīng)超聲波及離心提 取。取10ml上層清液，過(guò)赭曲霉毒素A免疫親和柱凈化，依次用真菌毒素清洗緩沖液、水淋 洗免疫親和柱。然后用lml甲醇洗脫，收集洗脫液，定容到2ml后，經(jīng)0.22ym有機(jī)相濾膜 過(guò)濾，得到待測(cè)樣品溶液。
[0021] 將待測(cè)樣品溶液在上述高效液相色譜儀條件下進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)赭曲霉毒素A測(cè)定結(jié) 果，計(jì)算其回收率，看哪組提取溶劑回收率最高，具體如表1所示： 表1不同組分配比的萃取劑對(duì)檢測(cè)蔬果中赭曲霉毒素A的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)蔬果中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 樣品前處理：取蔬果樣品碾碎，加入萃取劑，混勻，采用超聲波快速萃取30~60min， 萃取溫度為30~40°C，離心，取上清，將上清過(guò)赭曲霉毒素A免疫親和柱純化，依次用真菌 毒素清洗緩沖液、水淋洗免疫親和柱，然后用甲醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液過(guò)濾，取濾液 得到待測(cè)樣品溶液； 所述萃取劑為乙腈和四氫呋喃的混合液； 2) 建立赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)曲線； 3) 用液相色譜儀熒光檢測(cè)器檢測(cè)樣品溶液，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程計(jì)算得到待測(cè)樣 品溶液中赭曲霉毒素A的濃度，進(jìn)而計(jì)算得出樣品中赭曲霉毒素A的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述方法，其特征在于：步驟1)中所述萃取劑的用量為使蔬果樣 品濃度為〇? 4~0? 6g/ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述萃取劑為乙腈和四氫呋喃按體 積比（0. 8~1. 2) : (0. 8~1. 2)混合的混合液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述萃取劑為乙腈和四氫呋喃按體積比 1 :1混合的混合液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中所述離心為1800~2200r/min 離心8~12min〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中所述真菌毒素清洗緩沖液中含 有25g/L氯化鈉、5g/L碳酸氫鈉、0. 01%v/v吐溫20,余量為水。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中所述免疫親和柱純化時(shí)的流速 為1滴/s。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中所述淋洗時(shí)的流速為1滴/s。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中所述過(guò)濾的具體操作為：將洗 脫液經(jīng)0. 22ym有機(jī)相濾膜過(guò)濾。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述液相色譜儀熒光檢測(cè)器檢測(cè)為高效 液相色譜儀熒光檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)的條件如下： a) 色譜柱：cl8 柱 5ym，150mmX4. 6mm; b) 流動(dòng)相：為乙腈、水、冰乙酸按體積比為49. 5:49. 5:1的混合液； c) 柱流速：0. 9mL/min; d) 柱溫：35°C; e) 進(jìn)樣量：10yL; f) 檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)333nm，發(fā)射波長(zhǎng)477nm。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)蔬果中赭曲霉毒素A的方法，該方法以乙腈、四氫呋喃作為萃取劑，采用超聲波快速萃取法進(jìn)行萃取，再速離心取上清，這樣極大的提高了萃取效率，降低了樣品的基質(zhì)效應(yīng)，適用性強(qiáng)；再將上清用赭曲霉毒素A免疫親和柱進(jìn)行凈化，最后定容并過(guò)0.22μm有機(jī)相濾膜，得到上機(jī)待測(cè)液，這樣操作簡(jiǎn)單，凈化效果好；本方法適用于多種蔬果中赭曲霉毒素A的測(cè)定，該色譜技術(shù)花費(fèi)低，分離效果及色譜重現(xiàn)性好，可用于復(fù)雜基體中痕量組的赭曲霉毒素A定量快速測(cè)定。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號(hào)】CN104820032
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510211879
【發(fā)明人】李曉東, 岳瑞江, 何婷, 邱自兵
【申請(qǐng)人】深圳市宇馳檢測(cè)技術(shù)有限公司
【公開日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年4月29日