用于診斷和/或監(jiān)測結核病的生物標記的制作方法
【專利說明】用于診斷和/或監(jiān)測結核病的生物標記 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物標記，所述生物標記用于同時在具有免疫活性的和免疫缺損的個 體中診斷和/或監(jiān)測結核病，監(jiān)測個體對抗分枝桿菌化學治療的反應，監(jiān)測潛伏性結核病 向活動性結核病的發(fā)展，區(qū)分活動性結核病與潛伏性結核病和類似結核?。═B)的其它臨 床病況。本發(fā)明還涉及使用所述生物標記來診斷、治療和監(jiān)測結核病的方法。以上在所有 方面同時涉及肺部和肺外結核分枝桿菌感染，其中結核分枝桿菌是結核病的致病微生物。
[0002] 發(fā)明背景 結核分枝桿菌可論證為世界范圍的最成功的病原性微生物之一，并且是潛在致命的感 染性疾病結核病的病原體。它也是全世界內從潛在可治愈的感染性疾病所致死亡的主要原 因，估計每年有兩百萬相關死亡。
[0003] TB的發(fā)病機理復雜，最初發(fā)生感染是吸入氣溶膠化感染性結核分枝桿菌的結果。 針對桿菌損害的免疫應答影響了受感染個體是否將會繼續(xù)發(fā)展局部肺部疾病、潛伏性疾病 (LTBI)或作為血源性擴散的結果的散播性疾病。那些獲得性潛伏性疾病保持無癥狀，但保 留演變?yōu)榛顒有约膊〉目赡苄裕ㄟ@在一生中在所有病例的大約10%中發(fā)生）。
[0004] 估計大約三分之一的世界人口感染了潛伏性或活動性結核病。來自2011年的近 來Health Protection Agency (HPA)數(shù)據(jù)報告在UK總共有9, 042例活動性結核病。這代 表了在上一年度有5. 3%增加，并且表明在UK在流行率上呈上升趨勢。耐受抗生素的結核 分枝桿菌分離物的數(shù)量也在不斷上升。
[0005] 肺TB是結核分枝桿菌感染的最常見臨床表現(xiàn)。癥狀典型地包括慢性咳嗽伴有或 不伴有咯血、發(fā)熱、盜汗和體重減輕。僅患有活動性肺病的個體才保持感染性，因為他們具 有將桿菌氣溶膠化的能力。幾乎任何其他器官系統(tǒng)的感染都可能發(fā)生，并具有不同的伴隨 臨床表現(xiàn)。免疫缺損個體可能具有非典型表現(xiàn)。
[0006] 該病原體已經(jīng)表現(xiàn)出極大的復燃，這部分地由在撒哈拉以南非洲地區(qū)的HIV流行 所驅動，因為這些個體的免疫應答受損。這具有雙重影響。首先，個體更可能從已有的潛伏 性疾病發(fā)展為活動性疾病，第二，原發(fā)感染更可能表現(xiàn)為活動性疾病的形式，具有增加的感 染性。隨著增加的全球化，該氣溶膠化病原體的檢測、預防和早期合適治療正在成為日益重 要的公共衛(wèi)生中優(yōu)先考慮的問題。
[0007] 盡管有廣泛研宄，但目前對結核分枝桿菌的免疫應答和發(fā)病機理的理解仍然不完 全。此外，現(xiàn)有的診斷和治療方法是欠佳的。結核病是通過在臨床標本中的致病微生物（結 核分枝桿菌）的鑒定而確診。這通過長時間的微生物培養(yǎng)或通過PCR分析完成。確診的輔 助方法包括：診斷用成像（X射線或放射掃描）、結核菌素皮試（Mantoux/Heaf?試驗）和干 擾素Y釋放測定法（IGRA)。
[0008] 對于快速確診TB的現(xiàn)有障礙包括難以在實驗室中培養(yǎng)這種生長緩慢的微生物， 這會耗費大約3-12周，或難以獲得用于PCR的含有分枝桿菌DNA的合適樣品。后者在肺外 TB的情況下可能需要有創(chuàng)性采樣，這是昂貴的并且可能包括對患者的額外風險。
[0009] National Institute for Health and Clinical Excellence (NICE)目前正在評 價基于PCR的測定法（稱為"Xpert MTB/RIF試驗"），用于痰樣品，以診斷疑似活動性肺結 核病的病例，并檢測利福平抗性突變，這類突變是多重耐藥性結核病的標記。然而，該方法 學取決于所獲得的PCR-陽性樣品。
[0010] 作為欠佳的診斷工具的結果，抗微生物聯(lián)合化學治療的治療通常是根據(jù)臨床懷疑 以及輔助診斷試驗結果，憑經(jīng)驗進行。該方法的原理是雙重的?；颊呓邮芸刮⑸锘瘜W治 療的治療試驗，并且在肺結核病的情況下，通過降低痰中的桿菌載量而減少傳播。
[0011] 目前診斷的輔助方法包括：放射性成像、IGRA和結核菌素皮試（TST)。成像提供 了典型特征是否出現(xiàn)的指導，而IGRA和TST通過查詢針對TB-相關抗原的免疫應答，提供 了可能之前暴露給結核分枝桿菌（I (Mercy/iosis)的相關信息。IGRA試驗和TST試驗 的解釋是復雜的并且混雜許多因素。這些包括若干其它因素：在暴露前（潛伏性疾?。?，在 用BCG接種前，和免疫抑制。然而，IGRA在TB低流行國家中已經(jīng)日益成為可接受的輔助工 具，用于評價存在結核病的可能性?？上У氖?，成像、TST和IGRA試驗都不能確診活動性疾 病的存在。
[0012] 近來出版物已經(jīng)強調了使用生物標記的組合作為結核病的診斷工具的潛力。W0 03/075016描述了在血中可檢測的可溶性蛋白水平，即可溶性⑶抗原（"s⑶"）s⑶15、 s⑶23、s⑶27和s⑶54,在結核病患者中可能被改變。來自美國胸科協(xié)會（American Thoracic Society，ATS) 2010 國際會議的 Medscape Medical News 文章表明，IL-15 和 MCP-1的組合將84%患者準確地分類為具有活動性或潛伏性結核病。Chegou (第二屆IGRA 全球會議（2nd Global Symposium on IGRAs)，2009年5-6月）描述了相比單個分析物，分析 物組合是更有希望的TB診斷學并提出測量EGF、sCD40L、MIP-1 0、VEGF、TGF- a或IL-1 a 作為活動性TB的快速檢驗。Wu等人（2007) J Immunol 178，3688-3694指出IL-8、F0XP3 和IL-12 0提供了區(qū)分潛伏性結核分枝桿菌感染和活動性結核病疾病的手段。
[0013] 因為目前TB的診斷方法學欠佳，所以對于該病可用太多的治療選項。作為該病原 體的胞內性質的結果，以及在TB治療學領域缺乏足夠的創(chuàng)新的結果，TB治療基礎仍然是在 最簡單情況下在幾個月的延長時間內的聯(lián)合抗微生物化學治療。然而，對治療的部分依從 性可導致抗微生物劑的欠佳治療性水平，和抗生素抗性突變的微小進化。因此，患者可能在 較長的期限內保持感染性，并且增加了傳播頻率。這些抗性突變的發(fā)展（其中有些對所有 已知抗TB藥物無反應（多重耐藥性））近來在印度已經(jīng)引起高度關注。
[0014] 因此非常需要鑒定更有效的和高效的方法，用于同時確診活動性和潛伏性TB，尤 其是活動性和潛伏性TB的鑒別診斷。
[0015] 發(fā)明概沐 依據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供SCD170作為生物標記的用途，用于診斷和/或監(jiān)測結核 病。
[0016] 依據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供IFN-y和S⑶170作為生物標記的用途，用于診斷和 /或監(jiān)測結核病。
[0017] 依據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供診斷和/或監(jiān)測結核病的方法，包括在采自試驗 受試者的臨床樣品中檢測和/或定量測定SCD170,任選地與IFN-Y和/或本文中定義的一 種或多種另外的分析物生物標記組合。
[0018] 依據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供在個體中診斷結核病的方法，包括： (a) 從個體獲得試驗生物樣品； (b) 定量測定SCD170的量，任選地與IFN-Y和/或本文中定義的一種或多種另外的 分析物生物標記組合； (c) 比較所述試驗生物樣品中的所述分析物生物標記的量與一種或多種對照樣品中 存在的量，使得所述試驗生物樣品中的所述分析物生物標記水平的差異表明結核病的診 斷。
[0019]依據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供在患有或疑似患有結核病的受試者中監(jiān)測抗微 生物治療功效的方法，包括在所述受試者的樣品中檢測和/或定量測定SCD170,任選地與 IFN-y和/或本文中定義的一種或多種另外的分析物生物標記組合。
[0020] 依據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供在單個受試者中確定抗微生物結核病治療功效的 方法，包括： (a) 從個體獲得生物樣品； (b) 定量測定SCD170的量，任選地與IFN-y和/或本文中定義的一種或多種另外的 分析物生物標記組合； (c) 比較所述試驗生物樣品中的所述分析物生物標記的量與一種或多種對照樣品中 存在的量，使得所述試驗生物樣品中的所述分析物生物標記水平的差異表明結核病的診 斷。
[0021] 依據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供在有需要的個體中治療結核病的方法，其中所述 方法包括以下步驟： (a) 依據(jù)本文所述的方法在個體中診斷結核病；然后 (b) 在結核病陽性診斷的情況下將抗結核病藥物給予所述個體。
[0022] 本發(fā)明的進一步方面提供能夠與分析物生物標記特異性結合的配體，例如天然發(fā) 生的或化學合成的化合物。本發(fā)明的配體可包含能夠與分析物生物標記特異性結合的肽、 抗體或其片段、或適體或寡核苷酸。所述抗體可以是能夠與分析物生物標記特異性結合的 單克隆抗體或其片段。本發(fā)明的配體可以用可檢測標記來標記，例如發(fā)光、熒光或放射性標 記；或者或此外，本發(fā)明的配體可以用親和標簽來標記，所述標簽例如生物素、抗生物素蛋 白、鏈霉抗生物素或His (例如hexa-His)標簽。
[0023] 本發(fā)明的生物傳感器可包含能夠與針對分析物生物標記的抗體特異性結合的分 析物生物標記或其結構/形狀模擬物。還提供了陣列，其包含本文所述的配體或模擬物。
[0024] 本發(fā)明還提供能夠識別分析物生物標記的本文所述的一種或多種配體的用途，所 述配體可以是天然存在的或化學合成的，并且適宜地為肽、抗體或其片段、適體或寡核苷 酸、或任何其它天然或人工化學實體；或提供本發(fā)明生物傳感器、本發(fā)明的陣列、或本發(fā)明 的試劑盒的用途，用于檢測和/或定量檢測分析物。在這些用途中，可在生物樣品上進行 檢測和/或定量測定，所述樣品例如來自全血、血清、血漿、組織液、腦脊液（CSF)、滑液、濾 泡液、精液、羊水、乳汁、尿、胸水、腹水、支氣管肺泡灌洗液、唾液、痰、淚、汗水、淋巴液、吸出 物、骨髓吸出物和粘液，或從其中的提取物或純化物，或其稀釋液。
[0025]提供診斷或監(jiān)測試劑盒，以進行本發(fā)明的方法。這樣的試劑盒將適宜地包含用于 檢測和/或定量測定分析物生物標記的本發(fā)明的配體，和/或本文所述的生物傳感器和/ 或陣列，任選連同試劑盒使用說明書。
[0026] 本發(fā)明的進一步方面是試劑盒，包括生物傳感器，其能夠檢測和/或定量測定本 文定義的一種或多種分析物生物標記，用于監(jiān)測或診斷結核病。
[0027] 結核病的生物標記是發(fā)現(xiàn)新靶標和藥物分子的主要靶標，所述藥物減少或預防所 述病癥相關癥狀的發(fā)展。因為分析物生物標記水平表明病癥的診斷和藥物反應的可能性， 所以生物標記可用于在體外和/或在體內測定