一種用于測定抵抗素的膠乳增強免疫比濁試劑盒及其制備方法和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種膠乳增強免疫比濁試劑盒及其制備方法和檢測方法，特別涉及 一種用于測定抵抗素的膠乳增強免疫比濁試劑盒及其制備方法和檢測方法，本發(fā)明屬于疾 病的診斷或檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 抵抗素（resistin)是2001年Steppan等在小鼠脂肪細胞中發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞 因子，因它有降低胰島素敏感性的作用，故將其命名為抵抗素。它屬于抵抗素樣分子家族 (resistin-like molecules，RELMs)分泌型蛋白質(zhì)家族成員。
[0003] 人類抵抗素是一種12. 5kDa的蛋白質(zhì)，其前體含有108個氨基酸，分泌到血液的抵 抗素有兩種狀態(tài)，即六聚體和三聚體。它參與了炎癥反應(yīng)，與一些細胞因子、炎癥介質(zhì)、粘附 分子相互作用，能促進IL-6、IL-12等炎性細胞因子的合成和釋放。抵抗素具有類似炎癥因 子的蛋白分子結(jié)構(gòu)，與單核巨噬細胞的功能有關(guān)，能影響多形核白細胞的趨化運動和氧化 爆發(fā)，導(dǎo)致患者免疫功能紊亂，在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。抵抗素作為一種前炎性分 子，在機體出現(xiàn)炎癥的情況下呈高水平表達狀態(tài)。
[0004] 正常條件下人血清抵抗素的含量極低，約為14pg/ml (運用高效液相色譜分析）， 在機體出現(xiàn)炎癥的情況下，機體血液中抵抗素的含量急劇升高至60-350ng/ml。該指標(biāo)主要 用于潰瘍性結(jié)腸炎、消化性潰瘍急性穿孔及機體內(nèi)脂肪的沉積的實時監(jiān)測。
[0005] 許多臨床研宄證明，抵抗素在不同醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)υ\斷和指導(dǎo)治療有很高的價值，與 目前所應(yīng)用的診斷指標(biāo)相比，抵抗素在鑒別診斷以急癥腹痛為主訴的疾病及嚴(yán)重炎癥方面 提供了額外的信息。隨著臨床實踐性研宄的不斷深入，臨床數(shù)據(jù)的不斷積累，抵抗素將作為 一個全身性炎癥及以急癥腹痛為主訴的疾病輔助和鑒別診斷的常規(guī)指標(biāo)將成為共識，并將 得到廣泛的應(yīng)用。
[0006] 目前，在國內(nèi)市場上還不存在能夠?qū)Φ挚顾剡M行定量測定的檢測方法和相應(yīng)的試 劑盒。本發(fā)明通過膠乳增強免疫比濁法對患者血清中抵抗素水平的定量檢測，實現(xiàn)對以急 癥腹痛為主訴的常見疾病潰瘍性結(jié)腸炎、消化性潰瘍急性穿孔等的早期排查，同時也可實 現(xiàn)機體內(nèi)脂肪的沉積的實時監(jiān)測，為臨床醫(yī)生做出及時合理的診斷提供輔助工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的：本發(fā)明的第一個目的是提供一種測定抵抗素的膠乳增強免疫比濁試劑 盒，本發(fā)明所建立的用于測定抵抗素的膠乳增強免疫比濁試劑盒采用免疫比濁法，以乳膠 增強免疫比濁法為測定原理可實現(xiàn)對抵抗素的快速且準(zhǔn)確的檢測。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供了上述測定抵抗素的膠乳增強免疫比濁試劑盒的制 備方法。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供了測定抵抗素的膠乳增強免疫比濁試劑盒的檢測方 法。
[0010] 技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于測定抵抗素的膠乳增 強免疫比濁試劑盒，所述的試劑盒包括稀釋液、膠乳制劑、空白液、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品；其中所 述的膠乳制劑中含有分別偶聯(lián)了抵抗素單克隆抗體以及抵抗素多克隆抗體的不同粒徑大 小的羧基化的聚苯乙烯膠乳。
[0011] 其中，上述偶聯(lián)了抵抗素單克隆抗體的羧基化的聚苯乙烯膠乳的粒徑為50-80nm， 偶聯(lián)了抵抗素多克隆抗體的羧基化的聚苯乙烯膠乳的粒徑為150_200nm。
[0012] 其中，上述稀釋液為含有 2M NaCl，2% (w/w)PEG20000,0. 5% (w/w)BSA，0. 1% (w/ w)proclin-300 的 0· 05M pH = 8· 4 的 Tris-HCl 緩沖液。
[0013] 其中，上述空白液為0· 05Μ PBS磷酸緩沖液。
[0014] 其中，上述校準(zhǔn)品包括抵抗素濃度分別為0、0. 1、0. 5、2. 5、10、30 μ g/L的校準(zhǔn)品。
[0015] 其中，上述的質(zhì)控品中抵抗素的濃度為0. 21-0. 29 μ g/L。
[0016] 上述的用于測定抵抗素的膠乳增強免疫比濁試劑盒，包括以下步驟：1)稀釋液配 制；2)膠乳制劑的配制；3)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制；4)標(biāo)準(zhǔn)品的配制；5)校準(zhǔn)品及質(zhì)控品配 制；6)膠乳顆粒稀釋；7)將檢測合格的膠乳微粒工作液進行分裝組裝成試劑盒。
[0017] 其中，上述膠乳制劑的配制方法如下：1)羧基化的聚苯乙烯膠乳活化；2)偶聯(lián)了 抵抗素單克隆抗體的羧基化的聚苯乙烯膠乳的制備；3)偶聯(lián)了抵抗素多克隆抗體的羧基 化的聚苯乙烯膠乳的制備；4)將兩種膠乳溶液進行混合。
[0018] 用于測定抵抗素的膠乳增強免疫比濁試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：
[0019] 1)試劑配置：試劑開瓶即用，緩沖液及乳液試劑在測定前要充分混勻；
[0020] 2)先加入稀釋液試劑，再加入全血樣本，37 °C反應(yīng)5min后加入膠乳試劑讀取 0D570的檢測數(shù)據(jù)；
[0021] 3)結(jié)果計算：以人抵抗素重組蛋白濃度分別為0、0. 1、0. 5、2. 5、10、30yg/L的校 準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的抗原濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出。
[0022] 有益效果：本發(fā)明的方法分別對抵抗素單克隆抗體和抵抗素的多克隆抗體進行標(biāo) 記后，得到的大粒徑膠乳和小粒徑膠乳，提高了抵抗素的檢測的精確性、準(zhǔn)確性、檢測速率、 敏感度及敏感度。
【附圖說明】
[0023] 圖1為使用本發(fā)明的校準(zhǔn)品制備得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例 僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利 要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明 的保護范圍內(nèi)。
[0025] 本發(fā)明實施例所涉及主要材料及試劑的購買來源：
[0026] 抵抗素抗原購自杭州啟泰生物；抵抗素抗體貨號A90847HU01，購買自上海武昊經(jīng) 貿(mào)有限公司
[0027] EDC (I- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）、NHS (N-羥基琥珀酰亞胺）、 proclin-300購自SMGA ;聚苯乙烯膠乳購自美國Bangs ;其他的無機鹽試劑及PEG20000， 羧甲基纖維素鈉等均購自國藥試劑。
[0028] 實施例1 一種用于測定抵抗素的膠乳增強免疫比濁試劑盒的制備
[0029] 1、試劑配置
[0030] 1.1、稀釋液Rl配制
[0031] 配方：0· 05M Tris-HCl 緩沖液，含有 2M NaCl，2% (w/w)PEG20000,5% (w/w)BSA， 0. 1% (w/w)proclin-300, pH = 8. 4〇
[0032] I. 2、膠乳試劑R2的配制
[0033] (I)羧基化的聚苯乙烯膠乳活化
[0034] 10mg/ml的羧基化的聚苯乙稀膠乳Iml中加入50mM，PH6. IMES溶解的Img EDC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）和IOmg NHS (N-羥基琥珀酰亞胺）混 勾活化60min，離心19750rpm棄去上清，并用50mM PBS重懸；按照上述方法分別制備得到 了粒徑為50-80nm和150-200nm活化后的羧基化的聚苯乙烯膠乳，本實驗中所用的膠乳的 粒徑分別為60nm和150nm ;
[0035] (2)偶聯(lián)了抵抗素單克隆抗體的羧基化的聚苯乙烯膠乳的制備
[0036] 將Img抵抗素單克隆抗體加入2ml濃度為10m