使用新鮮冰凍組織檢測(cè)單克隆抗體類藥物組織交叉反應(yīng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)單克隆抗體類藥物組織交叉反應(yīng)的方法，特別是涉及一種使 用新鮮冰凍組織檢測(cè)單克隆抗體類藥物組織交叉反應(yīng)的方法。
【背景技術(shù)】
[000引單克隆抗體有特異性識(shí)別祀點(diǎn)的能力，具有藥效精確可控、副作用小的優(yōu)點(diǎn)，單克 隆抗體類藥物作為一種新型的生物技術(shù)藥物具有特定的免疫性，如果除去本身特定的祀器 官外，正常組織細(xì)胞中存在相同或相似的抗原決定簇，單克隆抗體類藥物則可能與非祀器 官外的其他組織或細(xì)胞結(jié)合，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此，單克隆抗體類藥物的組織交 叉反應(yīng)在藥物臨床前的安全性評(píng)價(jià)中非常重要，現(xiàn)被廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng) 域。
[0003] 然而在組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)中，組織標(biāo)本的處理是保證良好組織交叉結(jié)果的前提， 必須保證要檢測(cè)的組織取材新鮮，形態(tài)保存良好，抗原物質(zhì)的抗原不丟失，不擴(kuò)散或被破 壞。
[0004] 免疫組織交叉反應(yīng)的組織標(biāo)本主要包括石蠟切片和冰凍切片，然而在試驗(yàn)中，要 求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)需高溫烘片，可能會(huì)破壞組織的 抗原性，且石蠟切片包括取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、染色、封固一系列環(huán)節(jié)，操作步 驟不僅繁瑣，且若有某一環(huán)節(jié)的時(shí)間延長(zhǎng)都會(huì)影響組織抗原的檢出強(qiáng)度，同時(shí)存在著組織 抗原免疫活性弱，切片質(zhì)量不高，脫片嚴(yán)重等現(xiàn)象。
[0005] 因此，需開(kāi)發(fā)出一種有效保存組織抗原免疫活性，提高切片質(zhì)量，防止脫片現(xiàn)象的 單克隆抗體類藥物組織交叉反應(yīng)檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種使用新鮮冰凍組織檢測(cè)單克隆抗體類藥物 組織交叉反應(yīng)的方法。該方法能夠較好地保存組織的抗原免疫活性，提高切片質(zhì)量，防止脫 片，W及有效地簡(jiǎn)化了組織交叉反應(yīng)的操作步驟，加快實(shí)驗(yàn)流程。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的使用新鮮冰凍組織檢測(cè)單克隆抗體類藥物組織交 叉反應(yīng)的方法，包括步驟：
[0008] (1)新鮮冰凍組織采集；
[0009] ( 2 )制備新鮮冰凍組織標(biāo)本；
[0010] (3)將新鮮冰凍組織標(biāo)本制作成新鮮冰凍組織切片；
[0011] (4)利用新鮮冰凍組織切片檢測(cè)單克隆抗體類藥物的組織交叉反應(yīng)。
[0012] 所述步驟（1)中，采集的步驟為；使用解剖技術(shù)摘取新鮮組織，并剔除組織中多余 的脂肪及纖維，確保組織的完整及干凈。其中，組織包括；人和動(dòng)物的組織，如可包括；食蟹 猴的大腦皮質(zhì)，小腦淋己結(jié)、脾臟、肝臟、膜腺、小腸、肺臟、也臟、乳房、子宮、輸卵管、胎盤、 睪丸、前列腺、腎臟、皮膚、骨骼肌、甲狀腺、腎上腺、扁桃體、膀脫、結(jié)腸、主動(dòng)脈上皮、卵巢、 垂體、脊髓、輸尿管、眼和胸腺等。
[0013] 所述步驟（2)中，制備的步驟具體如下：
[0014] 將液氮罐中注滿液氮，在不鎊鋼燒杯內(nèi)加注4~7厘米高度的異戊焼，將該燒 杯放入液氮罐中，在金屬包埋模具(常規(guī)）底部涂抹少量冰凍組織包埋劑（0.C.T:化timal 化ttingTemperature),組織的欲取材面應(yīng)朝向模具底端進(jìn)行包埋，將標(biāo)注有臟器識(shí)別信 息的包埋盒置于組織上，注入冰凍組織包埋劑，將包埋模具放入異戊焼中，靜止1~3分鐘， 確保整個(gè)組織被充分凍結(jié)，形成新鮮冰凍組織標(biāo)本。
[0015] 另外，制備后的新鮮冰凍組織標(biāo)本可保存在-8(TC超低溫冰箱中。
[0016] 所述步驟（3)中，將新鮮冰凍組織標(biāo)本制作成新鮮冰凍組織切片的方法可參照 冰凍切片機(jī)說(shuō)明書進(jìn)行，其中，所述冰凍切片機(jī)的切片條件包括：冰凍切片機(jī)倉(cāng)內(nèi)溫度 為-1(TC~-3(TC，調(diào)整切片厚度至3~7ym。
[0017] 新鮮冰凍組織切片可保存在-8(TC超低溫冰箱中。
[0018] 所述步驟（4)中，檢測(cè)單克隆抗體類藥物的組織交叉反應(yīng)的步驟如下：
[0019] 1)將新鮮冰凍組織切片放于室溫干燥15~30分鐘后，放于冰水混合物冷卻的丙 麗中固定15~30分鐘，然后，置于室溫干燥30~60分鐘；
[0020] 2)將干燥過(guò)的新鮮冰凍組織切片浸入0.0 lmol/L PBS(磯酸緩沖液）中2~3次， 每次1~2分鐘，或?qū)⑿迈r冰凍組織切片放在0.0 lmol/L PBS中直至滴加試劑；
[0021] 3)在浸入過(guò)0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升的商品化 內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒中的卵白素試劑(購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），置于濕 盒內(nèi)在室溫下賠育10~20分鐘；
[002引 4)重復(fù)步驟2);
[0023] 5)在浸入過(guò)0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升內(nèi)源性生 物素阻斷試劑盒中的生物素試劑，置于濕盒內(nèi)在室溫下賠育10~20分鐘；
[0024] 6)重復(fù)步驟2);
[00巧]7)在浸入過(guò)0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升過(guò)氧化酶 阻斷劑，置于濕盒內(nèi)在室溫下賠育5~15分鐘；
[0026] 8)將新鮮冰凍組織切片浸入去離子水中1~2次，每次1~2分鐘，然后浸入 0.0 lmol/LPBS中1~2次，每次1~2分鐘，或?qū)⑿迈r冰凍組織切片放在0.0 lmol/L PBS 中，直至滴加試劑；
[0027] 9)在浸入過(guò)0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升動(dòng)物非免 疫血清(羊)，置于濕盒內(nèi)在室溫下賠育10~20分鐘后，將新鮮冰凍組織切片上的試劑漸除 并拭去新鮮冰凍組織切片周圍的試劑，滴加50~100微升的待檢測(cè)的單克隆抗體類藥物于 切片組織上，置于濕盒內(nèi)在室溫下賠育60~90分鐘；
[0028]其中，單克隆抗體類藥物包括；人猿化單克隆抗體類藥物；待檢測(cè)的單克隆抗體 類藥物中的單克隆抗體的使用濃度一般為2~4y g/mL ;
[002引 10)重復(fù)步驟2);
[0030] 11)在浸入過(guò)0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升鏈霉菌 抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶，置于濕盒內(nèi)在室溫下賠育10~20分鐘；
[0031] 12)重復(fù)步驟2);
[0032] 13)在浸入過(guò)0.Olmol/LPBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升DAB顯 色劑（即1XDAB試劑，由辣根過(guò)氧化氨酶DAB顯色試劑盒配制而成)，置于濕盒內(nèi)在室溫下 賠育2~10分鐘后，用水沖洗2~3分鐘，并用蘇木素復(fù)染切片2~4分鐘，用水沖洗8~ 10分鐘，使用封片膠進(jìn)行封片。
[0033] 14)顯微鏡下觀察反應(yīng)結(jié)果。
[0034]上述步驟1) -13)中所涉及的試劑，可均為商業(yè)化產(chǎn)品。
[0035] 本發(fā)明的使用新鮮冰凍組織檢測(cè)單克隆抗體類藥物組織交叉反應(yīng)的方法，提高了 冰凍組織制片技術(shù)、切片質(zhì)量，降低免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)的困難度，便于操作具有廣泛的應(yīng)用價(jià) 值。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 本發(fā)明的使用新鮮冰凍正常食蟹猴組織檢測(cè)制藥公司制造的單克隆抗體類藥 物--生物素化鼠抗人CD34單克隆陽(yáng)BEND/10]抗體（油30375)的組織交叉反應(yīng)的方法， 包括步驟：
[0037] 1)新鮮冰凍食蟹猴組織采集
[0038] 使用解剖技術(shù)一一摘取正常健康食蟹猴的組織，并剔除組織中多余的脂肪及纖 維，確保組織的完整及干凈。解剖前，將食蟹猴進(jìn)行放血處理，W避免組織切片時(shí)出現(xiàn)的冰 晶現(xiàn)象，便于切片的制備。其中，采用的放血方式可使用頸靜脈放血方式。
[0039] 2)制備新鮮冰凍組織標(biāo)本
[0040] 將液氮罐中注滿液氮，在不鎊鋼燒杯內(nèi)加注約