D-二聚體近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種D-二聚體近紅外法巧光檢測(cè)試劑盒 及其用途。
【背景技術(shù)】
[000引D-二聚體是交聯(lián)纖維特異性降解產(chǎn)物，也是繼發(fā)性纖溶特有代謝產(chǎn)物。D-二聚 體是在各種病理或生理狀態(tài)下，凝血系統(tǒng)激活導(dǎo)致凝血活酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白 體，并在活化因子X(jué)III的作用下形成交聯(lián)纖維蛋白。D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶講 解過(guò)程中所釋放碎片進(jìn)一步降級(jí)產(chǎn)生的含有丫鏈的片段。受到病理因素影響，機(jī)體凝血及 纖溶動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，凝血傾向不斷增加，從而導(dǎo)致纖維蛋白降解產(chǎn)物增加。因此，D-二 聚體含量升高，表明機(jī)體內(nèi)存在纖維蛋白血栓形成和纖溶發(fā)生，臨床上也將D-二聚體含量 的變化作為機(jī)體高凝狀態(tài)與纖溶亢進(jìn)狀態(tài)的分子標(biāo)志物。
[0003]D-二聚體的檢測(cè)是臨床對(duì)繼發(fā)性纖溶靈敏度較高、特異性強(qiáng)的檢驗(yàn)項(xiàng)目，是目前 判斷機(jī)體高凝狀態(tài)和鑒別原發(fā)性與繼發(fā)性纖溶、觀察溶栓治療效果等方面有重要臨床價(jià)值 的指標(biāo)。D-二聚體的檢測(cè)有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值；可用于彌漫性血管內(nèi)凝血值1C)的早期 診斷，深靜脈血栓值VT)及肺栓塞的篩查，急性腦梗死的早期診斷、治療和愈后觀察，肝病 的治療和診斷及對(duì)惡性腫瘤的療效和愈后觀察等。
[0004] 因此，對(duì)D-二聚體的快速、全面、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于W上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種D-二聚體近紅外巧 光法檢測(cè)試劑盒及其用途，用于建立高效可行的D-二聚體近紅外巧光檢測(cè)技術(shù)，解決現(xiàn)有 技術(shù)中的問(wèn)題。本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒結(jié)合近紅外巧光檢測(cè)技術(shù)，可快速，準(zhǔn)確的檢測(cè) 出人全血/血清/血漿中D-二聚體。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的第一方面提供一種D-二聚體近紅外巧光法檢測(cè)試劑盒，包括位于背板 上的試劑條，試劑條從加樣端開(kāi)始依次為樣品墊、標(biāo)記有免疫巧光探針的玻璃纖維素膜、包 被有抗D-二聚體單克隆抗體的硝酸纖維素膜和吸水紙。
[000引優(yōu)選的，所述免疫巧光探針為抗D-二聚體單克隆抗體包被的近紅外巧光乳膠微 球顆粒。
[0009] 優(yōu)選的，硝酸纖維素膜上包被的抗D-二聚體單克隆抗體和所述近紅外巧光乳膠 微球顆粒上包被的抗D-二聚體單克隆抗體可W為相同的抗D-二聚體單克隆抗體，也可W 為不同的抗D-二聚體單克隆抗體。
[0010] 更優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上包被的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam嚴(yán)Anti-D-Dimer抗體巧D1]，所述近紅外巧光乳膠微球顆粒上包被的抗D-二聚體單克 隆抗體為Abeam盛Anti-D-Dimer抗體巧D1]，或所述硝酸纖維素膜上包被的Abeam? Anti-D-Dimer抗體巧Dl]，所述近紅外巧光乳膠微球顆粒上包被的抗D-二聚體單克隆抗體 為Abeam篡Anti-D-Dimer抗體I!孤2]。
[0011] 更優(yōu)選的，所述巧光乳膠微球顆粒的直徑為140-160nm。
[001引近紅外光（NIR)，是介于可見(jiàn)光（VI巧和中紅外光（MIR)之間的電磁波，ASTM定義NIR為波長(zhǎng)在780nm-2526皿范圍內(nèi)的電磁波。在近紅外光區(qū)，生物體自吸收或巧光強(qiáng)度很 小，可避免背景干擾。同時(shí)由于散射光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方呈反比，近紅外區(qū)的散射干擾大 為減少。
[0013] 本發(fā)明的第二方面提供所述D-二聚體近紅外巧光法檢測(cè)試劑盒的制備方法，包 括如下步驟：
[0014] 1)用緩沖液將巧光乳膠微粒離屯、清洗并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒分 散液中加入抗D-二聚體單克隆抗體；加入邸CA使抗體與顆粒偶聯(lián)；再加入封閉液封閉乳 膠顆粒上多余的基團(tuán)，制備獲得探針溶液；
[0015] 2)將含有抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液噴加到硝酸纖維素膜上，烘干備用；
[0016]扣將步驟1)制備獲得的探針溶液浸潤(rùn)玻璃纖維薄膜，干燥備用；
[0017] 4)將步驟2)所得的硝酸纖維素膜、步驟3)所得的標(biāo)記有免疫巧光探針的玻璃纖 維素膜、樣品墊、吸水紙及背板組裝制備成D-二聚體近紅外巧光檢測(cè)試劑盒。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，再加入封閉液封閉乳膠顆粒上多余的基團(tuán)，并加入冠離， 制備獲得探針溶液，所述冠離選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠離-5、18-冠離-6中的一種 或多種的組合。
[0019] 更優(yōu)選的，步驟1)制備獲得的探針溶液中冠離的濃度為0.l-20mg/ml，更優(yōu)選為 4-8mg/ml。
[0020] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，緩沖液為磯酸鹽（PB巧緩沖液。
[002U 更優(yōu)選的，所述PBS緩沖液為0. 009-0.0 llmol/L，PH7. 25-7. 35的PBS緩沖液。
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，巧光乳膠微粒的直徑為140-160nm。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，乳膠顆粒、抗D-二聚體單克隆抗體、邸CA的重量比為 9-11 ;0. 9-1. 1 ;0. 9-1. 1。
[0024] 在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，乳膠顆粒、抗D-二聚體單克隆抗體、邸CA的投料量分 別為lmg、100ug、100ug。
[0025] 優(yōu)選的，所述封閉液為己醇胺，加入量為適量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況調(diào) 整己醇胺的用量。
[0026] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，所述緩沖溶液為PBS緩沖液。
[0027] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可選取適當(dāng)濃度和抑的PBS緩沖液，更優(yōu)選為0. 009-0.0 llmol/ L，PH7. 25-7. 35 的PBS緩沖液。
[002引優(yōu)選的，所述步驟2)中，含有抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液中還含有冠離， 所述冠離選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠離-5、18-冠離-6中的一種或多種的組合。
[0029] 更優(yōu)選的，所述含有抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液中冠離的濃度為 0.l-20mg/ml，更優(yōu)選為 4-8mg/ml。
[0030] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，含有抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液中抗D-二聚體 單克隆抗體的濃度為1. 8-2. 2mg/ml。
[0031] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液的噴加量為 0. 9-1. lul/cm。
[0032] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，烘干的具體條件為36-38°C烘箱烘干。
[0033] 所述噴加過(guò)程利用微量蛋白點(diǎn)膜系統(tǒng)。
[0034] 優(yōu)選的，所述步驟1)中的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam戀Anti-D-Dimer抗體 曲)1]，所述步驟2)中的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam?Anti-D-Dimer抗體曲)1]，或 所述步驟1)中的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam?Anti-D-Dimer抗體巧D1]，所述步驟 2)中的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam嚴(yán)Anti-D-Dimer抗體腳)2]。
[0035] 優(yōu)選的，所述步驟3)中，干燥的具體條件為真空干燥機(jī)干燥。
[0036] 本發(fā)明的第S方面提供了所述D-二聚體近紅外巧光法檢測(cè)試劑盒在D-二聚體檢 測(cè)領(lǐng)域的用途。
[0037] 所述用途具體為使用所述D-二聚體近紅外巧光法檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品中的D-二聚 體進(jìn)行檢測(cè)，所述樣品選自人全血、血清或血漿中的一種或多種的組合。
[003引本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒W人全血/血清/血漿為檢測(cè)樣本，結(jié)合近紅外巧光 檢測(cè)技術(shù)，可快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)出患者標(biāo)本中的D-二聚體。所述試劑盒采用免疫巧光層析 法，其最小可測(cè)量可達(dá)2.Oug/l，檢測(cè)方便、成本低，靈敏度高，特異性好，比同類定量診斷試 劑價(jià)格低20-30%，大大節(jié)約了社會(huì)醫(yī)療成本，檢測(cè)過(guò)程中樣品收集及處理簡(jiǎn)單，可快速準(zhǔn) 確的獲得結(jié)果，非常適合突發(fā)事件現(xiàn)場(chǎng)和基層使用，并可應(yīng)用到臨床檢測(cè)中，為臨床治療提 供定性依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0039]W下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可W通過(guò)另外不同的具體實(shí) 施方式加W實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可W基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0040] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一"和"該個(gè)"包括復(fù)數(shù)形式。
[0041] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)W及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可W使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0042] 除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。該些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)Sambrook 等MOLECULAR CLONING ;A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and "Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, J