纖維素（NC)膜；SARTORIUS(德國），CN140 ;
[0071] 牛血清白蛋白炬SA)，聚己二醇陽G20000,水解酪蛋白均為Sigma公司產品； [007引羊抗鼠IgG抗體；杭州啟泰生物科技有限公司；
[0073] 其它常用試劑均為分析純試劑。
[0074] 本實施例所述切sC-NAGL-CRPS聯(lián)試劑盒的制備方法包括；
[0075] (1)結合墊的制備：取1500yLPB緩沖液到離屯、管中，記作初始體系；取50yL巧 光微球溶液到初始體系中，充分混勻，記作微球體系；用PB緩沖液配置2. 5mg/mLEDC溶液， 向微球體系中加入10y以立即吹打混勻，活化微球表面駿基25min左右，記作活化體系； 取22yL抗體溶液，用PB緩沖液稀釋到200yL記作稀釋抗體；待活化時間到，將稀釋抗 體加入活化體系中，立即混勻，室溫反應化，記作反應體系；將反應完全的反應體系在8°C， 14000巧m條件下離屯、20min，棄上清，用1000yL重懸液重懸，即為標記溶液；將制得的免疫 巧光乳膠微球涂布于玻璃纖維素膜或無紡布上制成免疫巧光結合墊；
[0076] 似抗體承載膜的制備；將與切sC、NGAL、CRP相對應的抗體用0. 01M抑7. 4PBS稀 釋成1. 0mg/ml、l. 5mg/ml、2.Omg/ml，劃線噴涂于抗體承載膜，形成所述第一檢測線、第二檢 測線、第S檢測線，并將抗鼠IgG抗體稀釋至Img/ml并劃線噴涂形成所述質控線。包被完 成后將NC膜在溫度20~25°C，相對濕度< 30%的干燥間干燥2~5小時。將干燥后的NC 膜置于封閉液（含1%BSA的0. 01MpH7. 4PB巧中37°C封閉1小時，取出后置37°C下烘干 處理2小時備用；
[0077] (3)組裝；在干燥室內（溫度20~25°C，濕度小于40% )，取塑料底板，將已包被 的NC膜放置在塑料底板的中部粘貼，將結合墊裁切成合適的寬度，在NC膜T線一側搭接結 合墊，在結合墊另一側搭接粘貼上樣墊，在NC膜C線一側搭接吸樣墊，最后用裁剪機將貼好 塑料板切成3~5mm寬的試紙條，再裝入塑料卡內，形成試紙卡。
[007引所述試劑卡與巧光檢測儀搭配，即可構成用于日常腎臟衰竭的早期預警、治療過 程和愈后監(jiān)控的試劑盒。
[0079] 實驗例1
[0080] W實施例1所述制備的膠體金墊的切sC-NAGL-CRPS聯(lián)試劑盒為例，對本發(fā)明所 述的=聯(lián)試劑盒的檢測準確性進行驗證。
[0081] 取臨床確診的腎衰病人血樣12例，W實施例1所述膠體金墊的切sC-NAGL-CRPS 聯(lián)試劑盒進行定性檢測，將血樣滴加至所述試劑盒檢測口，15分鐘后觀察=條檢測線的顏 色深淺，并配合顯色卡進行半定量判斷，當切sC-NAGL-CRPS條檢測線顏色分別深于對應 比色卡切sClmg/L、NAGL100yg/L、CRP8mg/L位置的顏色時，檢測結果為陽性；反之，檢 測結果為陰性。具體檢測結果見表1，與臨床結果對照，該試劑盒的陽性檢出率100%。
[0082]表1腎衰病人的切sC-NAGkCRP檢測結果
[0083]
【主權項】
1. 一種快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡，其特征在于，所述試劑卡以血清半胱氨酸蛋白酶 抑制劑（CysC)、中性粒細胞明膠酶相關性脂質運載蛋白（NAGL)及C反應蛋白（CRP)為檢測 標志物。
2. 根據權利要求1所述的快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡，其特征在于，所述試劑卡包括 樣品區(qū)、抗體結合區(qū)，檢測控制區(qū)及吸水區(qū)；所述抗體結合區(qū)含有CysC、NGAL、CRP的特異性 抗體，所述檢測控制區(qū)含有分別與CysC、NGAL、CRP相對應的單克隆抗體、多克隆抗體，或相 應的抗原。
3. 根據權利要求2所述的快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡，其特征在于，所述試劑卡包括： 底板（1)以及沿所述底板（1)的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊（2)、結合 墊（3)、抗體承載膜（4)和吸樣墊（9)，且所述樣品墊（2)、結合墊（3)、抗體承載膜（4)和吸 樣墊（9)之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊； 所述抗體承載膜（4)粘附于所述底板（1)的中間部位，其上順次設置有第一檢測線 (5)、第二檢測線（6)、第三檢測線（7)和質控線（8)，所述第一檢測線（5)靠近所述結合墊 (3)，所述質控線（8)靠近所述吸樣墊（9); 所述結合墊（3)上噴涂有CysC、NGAL、CRP三種特異性抗體； 所述第一檢測線（5)、第二檢測線（6)、第三檢測線（7)分別彼此獨立的由與CysC、 NGAUCRP相對應的單克隆抗體、多克隆抗體或相應的抗原涂層形成，且彼此不同。
4. 根據權利要求3所述的快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡，其特征在于， 所述第一檢測線（5)、第二檢測線（6)及第三檢測線（7)相間隔平行設置，或者彼此不 重疊的并列設置。
5. 根據權利要求3-4任一所述的快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡，其特征在于，所述質控 線（8)由抗鼠IgG抗體涂層形成。
6. 根據權利要求3-5任一所述的快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡，其特征在于，制備所述 結合墊（3)的載體包括膠體金納米顆粒、熒光膠乳、磁珠、量子點或稀土元素。
7. 根據權利要求3-6任一所述的快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡，其特征在于，所述結合 墊（3)為膠體金墊，由標記有CysC、NAGL、CRP抗體的膠體金納米顆粒噴涂于玻璃纖維素膜 或無紡布上制成；或者， 所述結合墊（3)為免疫熒光墊，由免疫熒光物質標記的乳膠微球噴涂于玻璃纖維素膜 或無紡布上制成。
8. 根據權利要求3-7任一所述的快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡，其特征在于，所述結合 墊⑶上，所述CysC、NGAL、CRP三種特異性抗體分別與不同顏色的量子點相結合。
9. 一種制備權利要求1-7任一所述快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡的方法，其特征在于， 包括如下步驟： (1) 結合墊的制備：按照現(xiàn)有技術常規(guī)方法將標記有CysC、NAGL、CRP特異性抗體的載 體顆粒噴涂于玻璃纖維素膜或無紡布上，烘干備用； (2) 抗體承載膜的制備：將與CysC、NGAL、CRP相對應的單克隆抗體、多克隆抗體或相應 的抗原稀釋，劃線噴涂于抗體承載膜，形成所述第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線，并將 抗鼠IgG抗體稀釋并劃線噴涂形成所述質控線，烘干備用； (3) 組裝：在底板上順次粘結樣品墊、結合墊、抗體承載膜和吸樣墊，各部分依次與且 僅與相鄰部位相接觸且部分重疊，切割成條，裝入塑料卡內即形成所述試紙卡。
10. 根據權利要求9所述的制備快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑卡的方法，其特征在于： 所述結合墊為膠體金墊，其制備步驟具體包括：將標記有CysC、NAGL、CRP抗體的膠體 金納米顆粒噴涂于玻璃纖維素膜或無紡布上，烘干備用；或者 所述結合墊為免疫熒光墊，其制備步驟具體包括： (a) 取熒光物質標記的乳膠微球與抗CysC、NGAL、CRP的特異性抗體結合，制得標記有 特異性抗體的熒光乳膠微球； (b) 將步驟（a)中制得的免疫熒光乳膠微球涂布于玻璃纖維素膜或無紡布上制成免疫 焚光結合墊。
11. 一種快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑盒，其特征在于，由權利要求1-9任一所述的試劑卡 與比色卡和/或膠體金定量讀數儀組成；或者， 由權利要求1-9任一所述的試劑卡與熒光檢測儀組成。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種用于腎臟衰竭的早期預警、治療過程和愈后監(jiān)控的三聯(lián)試劑盒，并進一步公開了其制備方法和應用。所述試劑卡以血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CysC)、中性粒細胞明膠酶相關性脂質運載蛋白(NAGL)及C反應蛋白(CRP)為檢測標志物。本發(fā)明三聯(lián)試劑卡以NGAL-CysC-CRP三聯(lián)抗體為標記物，可有效監(jiān)測腎衰的風險，尤其對糖尿病人、交通事故發(fā)生者的急性腎衰監(jiān)測起到了意想不到的效果，其診斷急性腎衰靈敏度高、特異性強，臨床監(jiān)測的準確率高達95％，使糖尿病人腎病的自我檢測和監(jiān)測成為可能，用于腎病的早期預警，可及時阻止病人的病情惡化，減輕病人的腎損傷程度。
【IPC分類】G01N33-68, G01N33-531
【公開號】CN104865384
【申請?zhí)枴緾N201510197628
【發(fā)明人】胡文波, 李靜
【申請人】江蘇金標世紀生物科技有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年4月23日