一種石英毛細管親和層析柱的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一種層析柱的制備方法，特別地，本發(fā)明提供了一種石英毛細管親和層析柱的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]層析技術(shù)在生物分子分離與分析中應(yīng)用十分廣泛，可高效、快速地從混合物中分離出目標(biāo)物或去除雜質(zhì)，也常用于樣品濃縮、凈化或溶液置換等。親和層析是層析技術(shù)的一種，將可與目標(biāo)物特異性結(jié)合的配基(如抗體、蛋白質(zhì)、酶或其抑制劑等)固定在層析柱內(nèi)，當(dāng)樣品溶液通過層析柱時目標(biāo)物與固定在層析內(nèi)的配基特異性結(jié)合而滯留在層析柱中，其它不被吸附的分子直接流出，通過選用適當(dāng)?shù)娜芤合疵搶游鲋蓪⒈唤Y(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫出，從而實現(xiàn)目標(biāo)物分子的分離。常規(guī)親和層析技術(shù)是將親和配基(如抗體或酶的抑制劑等)固定在親和層析介質(zhì)(微球)上，再將層析介質(zhì)裝填到層析柱內(nèi)，這種親和層析技術(shù)常用于大量樣品的高效分離，如細胞因子、抗體或酶抑制劑的分離純化。
[0003]親和層析技術(shù)由于其分離特異性強、高濃縮比和快速等特點在分析和檢測中的應(yīng)用日益廣泛。在疾病診斷、污染物檢測和農(nóng)藥殘留分析等領(lǐng)域，常借助親和層析將樣品進行處理，再使用分析儀器(如質(zhì)譜)或化學(xué)發(fā)光技術(shù)進行目標(biāo)物檢測，所需的樣品體積較小，經(jīng)常是毫升或微升級，如基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜的檢測技術(shù)，所需樣品體積常常低于3微升。基于層析微球的親和層析技術(shù)所需樣品體積較大，對于微量或痕量樣品而言，采用常規(guī)的親和法將導(dǎo)致樣品被稀釋或回收率低，造成目標(biāo)物難以被有效地檢測出，導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果。另外，常規(guī)層析技術(shù)也難應(yīng)用于微量蛋白質(zhì)樣品的脫鹽和濃縮、小分子標(biāo)記物去除、添加物或酶的保護劑去除等。
[0004]由于傳統(tǒng)親和層析技術(shù)在分析和檢測應(yīng)用中存在的問題，尤其是樣品預(yù)處理過程中存在的難于處理微量或痕量樣品、處理過程導(dǎo)致樣品稀釋嚴(yán)重以及難以批量處理等問題，本發(fā)明旨在提供一種石英毛細管親和層析柱的制備方法，使其更適于基于儀器分析或化學(xué)發(fā)光樣品的微量或痕量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種石英毛細管親和層析柱的制備方法，通過毛細管表面處理和配基偶聯(lián)，制備出可用于微量或痕量樣品親和層析處理的毛細管層析柱。本發(fā)明的一種石英毛細管親和層析柱的制備方法包括以下步驟:
[0006](I)石英毛細管內(nèi)壁處理，將體積比為3:7?7:3的95%的硫酸與H2O2混合液注入到內(nèi)徑為10微米-500微米的石英毛細管，在70°C -90°c下恒溫處理0.2h_2h，使用10倍毛細管體積的去離子水沖洗毛細管內(nèi)壁，使用高純氮氣將毛細管內(nèi)壁吹干。
[0007](2)石英毛細管內(nèi)壁氨基衍生，將氨基硅烷溶于苯或苯同系物溶液中，濃度控制在0.01mol/L-lmol/L，將溶液注入到石英毛細管，在10°C _50°C放置10min-60min，使用10倍毛細管體積的甲苯或苯清洗毛細管內(nèi)壁，使用高純氮氣將毛細管內(nèi)壁吹干。
[0008](3)多糖活化，取瓊脂糖或魔芋葡甘聚糖溶于0.5mol/L-3mol/L的NaOH溶液(含lmg/mL-20mg/mL的硼氫化鈉),在10°C _50°C反應(yīng)lh_5h,加入1，4-丁二醇-二縮水甘油醚，在10°C -50°C反應(yīng)5h-15h。加入反應(yīng)液體積2倍的乙醇，離心后收集沉淀出的多糖，重新懸浮在 0.1moI/L-1OmoI/L 的 NaHCO3-Na2CO3 緩沖液。
[0009](4)多糖偶聯(lián)，將步驟(3)獲得的活化后的多糖溶液注入步驟(2)處理后的石英毛細管，在10°c -50°c范圍內(nèi)放置lh-6h，使用10倍毛細管體積的NaHCO3-Na2CO3緩沖液(0.lmol/L-10mol/L)沖洗毛細管。
[0010](5)蛋白質(zhì)配基偶聯(lián)，將配基蛋白質(zhì)溶解于0.lmol/L-10mol/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖液，濃度控制在0.5mg/ml-5mg/ml ;將該溶液注入到步驟(4)處理后的毛細管后在10C -50°C放置lh-5h，使用10倍毛細管體積的清水清洗毛細管。
[0011](6)封閉:將乙醇胺溶液(濃度Imol/L-lOmol/L)注入到步驟(5)處理后的毛細管，在10°C -50°c反應(yīng)lh-6h，依次用10倍毛細管體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.0-5.0)和硼酸-四硼酸鈉緩沖液(PH8.0-9.0)及去離子水清洗毛細管內(nèi)壁，獲得內(nèi)壁偶聯(lián)蛋白質(zhì)配基的毛細管層析柱。
[0012]優(yōu)選地，所述步驟(I)石英毛細管內(nèi)壁處理過程中硫酸與H2O2的比例控制在5:5到 7:3。
[0013]優(yōu)選地，所述步驟(2)石英毛細管內(nèi)壁氨基衍生過程中使用的氨基硅烷可以是3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基戊基三乙氧基硅烷、3-氨基己基三乙氧基硅烷。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟(2)石英毛細管內(nèi)壁氨基衍生過程中用于溶解氨基硅烷的溶劑可以是苯或苯同系物，更為優(yōu)選地可以是甲苯。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟(3)多糖活化過程中使用的糖可以是瓊脂糖或魔芋葡甘聚糖，其分子量范圍可控制在1kDa?200kDa。
[0016]本發(fā)明的特點在于一種石英毛細管親和層析柱的制備方法，通過石英毛細管內(nèi)壁處理技術(shù)將氨基引入到毛細管內(nèi)壁，通過活化技術(shù)將多糖鏈上引入環(huán)氧基團，將活化后的多糖偶聯(lián)到石英毛細管內(nèi)壁后，再將蛋白質(zhì)配基偶聯(lián)到固定在石英毛細管內(nèi)壁的多糖鏈上。本發(fā)明的一種石英毛細管親和層析柱的制備方法其優(yōu)點在于:
[0017](I)石英毛細管親和層析柱的制備過程簡單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。
[0018](2)制備的石英毛細管親和層析柱內(nèi)不含有微球等固體顆粒填料或常規(guī)層析介質(zhì)，樣品溶液在層析柱內(nèi)流動阻力小。
[0019](3)石英毛細管親和層析柱體積小，所需樣品量小，非常適于微量或痕量樣品的處理。
【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明的一種石英毛細管親和層析柱的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖
【具體實施方式】
[0021]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，值得提出的是，實施例只是對本發(fā)明的一種石英毛細管親和層析柱的制備方法的說明，并不能代表本發(fā)明專利的全部，更不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，在不脫離本發(fā)明實質(zhì)的構(gòu)思的前提條件下，還可以做出若干調(diào)整或改進，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0022]實施例1:
[0023]石英毛細管:內(nèi)徑100微米，壁厚30微米。瓊脂糖:純度95%，分子量范圍10kDa-15kDa。配基蛋白:牛胰蛋白酶抑制劑。氨基硅烷:3_氨基丙基三乙氧基硅烷。
[0024](I)石英毛細管內(nèi)壁處理，將體積比為7:3的95%的硫酸與H2O2混合液注入到內(nèi)徑為石英毛細管，在90°C下恒溫處理I小時，使用10倍毛細管體積的去離子水沖洗毛細管內(nèi)壁，使用高純氮氣將毛細管內(nèi)壁吹干。
[0025](2)石英毛細管內(nèi)壁氨基衍生，將氨基硅烷溶于甲苯，濃度控制在0.05mol/L，將該溶液注入到石英毛細管，在25°C放置30min，使用10倍毛細管體積的甲苯或苯清洗毛細管內(nèi)壁，使用高純氮氣將毛細管內(nèi)壁吹干。
[0026](3)瓊脂糖活化，取瓊脂糖溶于0.5moI/L的NaOH溶液(含10mg/mL的硼氫化鈉)，濃度控制在lmg/ml，在25°C反應(yīng)lh，加入1，4-丁二醇-二縮水甘油醚，在25°C反應(yīng)5h。加入反應(yīng)液體積2倍的乙醇，離心后收集沉淀出的瓊脂糖，重新懸浮在lmol/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖液。
[0027](4)瓊脂糖偶聯(lián)，將步驟(3)獲得的活化后的瓊脂糖溶液注入步驟(2)處理后的石英毛細管，在25°C范圍而內(nèi)放置4h，使用10倍毛細管體積的NaHCO3-Na2CO3緩沖液(0.lmol/L-10mol/L)沖洗毛細管。
[0028](5 )胰蛋白酶抑制劑偶聯(lián)，將胰蛋白酶抑制劑溶解于0.lmol/L-10mol/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖液，濃度控制在lmg/ml ;將該溶液注入到步驟(4)處理后的毛細管后在25°C放置3h，使用10倍毛細管體積的清水清洗毛細管。
[0029](6)封閉:將lmol/L的乙醇胺溶液注入到步驟(5)處理后的毛細管，在37°C下反應(yīng)2h，依次用10倍毛細管體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.0-5.0)和硼酸-四硼酸鈉緩沖液(pH8.0-9.0)及去離子水清洗毛細管內(nèi)壁，獲得內(nèi)壁偶聯(lián)胰蛋白酶抑制劑的毛細管層析柱。
【主權(quán)項】
1.一種石英毛細管親和層析柱的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟: (1)石英毛細管內(nèi)壁處理，將體積比為3:7?7:3的硫酸與H2O2混合液注入到石英毛細管，在70°C -90°C下恒溫處理0.2h-2h，使用10倍毛細管體積的去離子水沖洗毛細管內(nèi)壁，使用高純氮氣將毛細管內(nèi)壁吹干； (2)石英毛細管內(nèi)壁氨基衍生，將氨基硅烷溶于苯或甲苯，濃度控制在0.01-lmol/L，將溶液注入到石英毛細管，在10°C-50°C范圍而內(nèi)放置10min-60min，使用10倍毛細管體積的甲苯或甲苯清洗毛細管內(nèi)壁，使用高純氮氣將毛細管內(nèi)壁吹干； (3)多糖活化，取瓊脂糖或魔芋葡甘聚糖溶于含lmg/ml-20mg/ml硼氫化鈉的0.5mol/L-3mol/LNa0H溶液，在10 V -50 °C反應(yīng)lh_5h，加入1，4- 丁二醇-二縮水甘油醚，在10C -50°C反應(yīng)5h-15h，加入反應(yīng)液體積2倍的乙醇，離心后收集沉淀出的多糖，重新懸浮在 0.1moI/L-1OmoI/L 的 NaHCO3-Na2CO3 緩沖液； (4)多糖偶聯(lián)，將步驟(3)獲得的活化后的多糖溶液注入步驟(2)處理后的石英毛細管，在10°C _50°C范圍內(nèi)放置lh-6h，使用10倍毛細管體積的0.1moI/L-1OmoI/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖液沖洗毛細管； (5 )蛋白質(zhì)配基偶聯(lián)，將配基蛋白質(zhì)溶解于0.1moI/L-1OmoI/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖液，濃度控制在0.5mg/ml-5mg/ml ;將該溶液注入到步驟(4)處理后的毛細管后在10C -50°C放置lh-5h，使用10倍毛細管體積的清水清洗毛細管； (6)封閉:將濃度為Imol/L-lOmol/L的乙醇胺溶液注入到步驟(5)處理后的毛細管，在10°C -50°C反應(yīng)lh-6h，依次用10倍毛細管體積的pH4.0-5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液和PH8.0-9.0的硼酸-四硼酸鈉緩沖液及去離子水清洗毛細管內(nèi)壁，獲得內(nèi)壁偶聯(lián)蛋白質(zhì)配基的毛細管層析柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中使用的氨基硅烷可以是3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基戊基三乙氧基硅烷或3-氨基己基三乙氧基硅烷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)使用的多糖是分子量范圍為1kDa?200kDa的瓊脂糖或魔芋葡甘聚糖。
【專利摘要】一種石英毛細管親和層析柱的制備方法，該方法包括石英毛細管內(nèi)壁處理、石英毛細管內(nèi)壁氨基衍生、瓊脂糖活化、瓊脂糖偶聯(lián)、蛋白質(zhì)配基的偶聯(lián)和封閉步驟。其特點在于毛細管親和層析柱的制備過程簡單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，層析柱內(nèi)不含有微球等固體顆粒填料或常規(guī)層析介質(zhì)，樣品溶液在層析柱內(nèi)流動阻力小，在實際應(yīng)用中所需樣品量小，適于微量或痕量樣品的處理。
【IPC分類】G01N1-40, G01N1-34
【公開號】CN104880357
【申請?zhí)枴緾N201410073365
【發(fā)明人】張貴鋒, 蘇志國, 馬光輝, 孔英俊, 康躋耀
【申請人】中國科學(xué)院過程工程研究所
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2014年2月28日