一種基于納米氧化銅和單層分子膜的傳感元件的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及電化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種基于納米氧化銅和單層分子膜的傳感 元件的制備方法。
【背景技術(shù)】
[000引快喃挫酬（又名頻特靈，化razolidone，F(xiàn)幻，化學(xué)名為N-(5-硝基-2-慷基-3-氨 基）-2-曠挫燒酬陽(yáng)-巧-11；[化0-化計(jì)11巧11(1日]1日-3-3111；[]10)-2-(^32〇11(1；[]1〇]1日]，屬于硝基快 喃類抗生素藥物，是一種人工合成的具有較廣抗菌譜的藥物，它能夠有效抑制常見的革蘭 氏陰性菌和陽(yáng)性菌，W及部分原蟲、真菌。二十世紀(jì)，快喃挫酬作為獸藥，廣泛應(yīng)用于食用 動(dòng)物預(yù)防和治療胃腸道感染。但是由于快喃挫酬具有致癌性和致突變性，尤其是其代謝物 3-氨基-2-曠挫燒酬（F'urazolidone3-amin〇-2-〇xazolidinone，AO幻，毒性和穩(wěn)定性比快 喃挫酬更強(qiáng)，世界很多國(guó)家就完全禁止在食用動(dòng)物中使用。在我國(guó)，最新的《動(dòng)物性食品中 獸藥最高殘留限量》，快喃挫酬被列為"禁止使用的藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出"。但因 快喃挫酬的藥效性高、價(jià)格便宜，其使用卻屢見不止，在動(dòng)物源性食品，尤其是水產(chǎn)品中屢 屢發(fā)現(xiàn)快喃挫酬及其代謝物的殘留。2003年，歐盟通過食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)告知其成 員國(guó)在從多國(guó)進(jìn)口的水產(chǎn)品中檢測(cè)出A0Z。2006年，上海市食品監(jiān)督管理局發(fā)布嚴(yán)重消費(fèi) 預(yù)警指示，在對(duì)多寶魚的專項(xiàng)抽檢中，30多件多寶魚樣品硝基快喃類藥物殘留全部超標(biāo)。
[0003] 快喃挫酬及其代謝物A0Z的檢測(cè)，其主要方法是儀器分析方法，諸如HPLC、MS、 LC-MS和HPLC-MS/MS等。但其存在耗時(shí)長(zhǎng)、儀器昂貴、操作專業(yè)等，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足我國(guó)市場(chǎng) 快速檢測(cè)的需求。同時(shí)A0Z的檢測(cè)，往往需要對(duì)A0Z進(jìn)行衍生化，使得前處理更為復(fù)雜，更 難控制。許多學(xué)者建立了許多免疫檢測(cè)技術(shù)。
[0004] 近年來，由于免疫傳感器技術(shù)具有分析速度快、可信度高、適合樣品初級(jí)篩選檢測(cè) 等優(yōu)點(diǎn)，許多學(xué)者研究紛紛研究農(nóng)藥、獸藥和抗生素等小分子的免疫傳感器檢測(cè)方法。而 電化學(xué)免疫傳感器是免疫傳感器中最早研究、最多種類、比較成熟的一個(gè)分支，具有靈敏度 高、檢測(cè)費(fèi)用低、靈活快捷等優(yōu)點(diǎn)，其關(guān)鍵技術(shù)是抗體固定，即把抗體固定在電極上制備高 靈敏的免疫傳感元件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是發(fā)揮納米材料表面積大的優(yōu)勢(shì)，制備氧化銅納米-琉基丙酸復(fù)合 膜，建立一種高靈敏的食品中快喃挫酬及其代謝物的電化學(xué)傳感檢測(cè)技術(shù)，將電化學(xué)免疫 傳感器應(yīng)用于食品中快喃挫酬及其代謝物的痕量檢測(cè)，具有較大的現(xiàn)實(shí)意義。
[0006] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案；
[0007] 本發(fā)明的基于納米氧化銅和單層分子膜的傳感元件的制備方法的具體步驟如 下：
[000引 （1)用0.Imol/L化0H和0.Imol/LHN03分別淋洗金電極立次，每次Imin，再置于 新鮮配制的piranha溶液，浸泡30min;
[0009] (2)取出金電極，超純水淋洗Imin，置于超純水中超聲清洗3min，無水己醇中超聲 清洗3min，重復(fù)3次；
[0010] (3)依次用0. 3ym和0. 05ymAl2〇3粉末拋光至呈鏡面后，金電極置于piranha溶 液，浸泡30min，重復(fù)步驟（2)，然后用高純氮吹干金電極表面；
[0011] (4)用無水己醇溶解氧化銅納米材料成0. 5mg/mU滴加氧化銅納米己醇溶液于 金電極上，用氮?dú)獯蹈珊蟮玫窖趸~納米/金電極；把金電極浸于=琉基丙酸溶液中溫育 12h，依次用超純水、無水己醇淋洗=次，每次Imin，然后用高純氮吹干金電極表面，即為 MPA/氧化銅納米/金電極，然后將金電極浸于碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-哲基硫代班巧亞胺 溶液的混合液中1化后，用超純水淋洗3min，再將金電極浸于含有0. 3mg/mLAOZ抗體的磯酸 緩沖液中，4°C過夜，最后用超純水清洗，高純氮吹干金電極表面，即為AOZ抗體/MPA/氧化 銅納米/金電極。
[001引步驟（1)和步驟（3)中，所述的piranha溶液是由30wt%的&02和濃硫酸組成， 兩者的體積比為1:3。
[001引步驟（4)中，所述的氧化銅納米材料的制備方法如下：配制0.Imol/L的 化(N03)2? &0溶液50mU向溶液中加入0. 02mol/L的十二烷基橫酸鋼溶液5mU攬拌，然后 用2mol/L的氨氧化鋼溶液調(diào)節(jié)抑至10,將溶液置于75°C的水浴環(huán)境中反應(yīng)12h，待反應(yīng)完 成后將溶液離屯、分離，用蒸饋水和無水己醇分別洗漆沉淀3次，產(chǎn)物在60°C下干燥化，即為 納米氧化銅。
[0014] 步驟（4)中，所述的立琉基丙酸（MPA)溶液的濃度為0.Imol/L。
[0015] 步驟（4)中，所述的碳二亞胺鹽酸鹽巧DC)溶液和N-哲基硫代班巧亞胺（N服）溶 液的濃度均為0.lmol/1，混合液中兩者的體積比為1: 1。
[0016] 步驟（4)中，所述的A0Z抗體的制備方法如下：選取兩只新西蘭大白兔，背部皮下 多點(diǎn)注射500ygAOZ-BSA，其中A0Z-BSA用生理鹽水稀釋，加等體積的完全弗氏佐劑充分 乳化，在15d，再次注射相同劑量經(jīng)不完全弗氏佐劑充分乳化的免疫原，29d、39d和49山注 射250yg經(jīng)不完全弗氏佐劑充分乳化的免疫原，59d后，耳靜脈取血，測(cè)定抗體效價(jià)和特異 性，效價(jià)合適后，屯、臟完全取血，分離及純化抗血清。
[0017] 步驟（4)中，所述的磯酸緩沖液的抑為7. 4。
[001引本發(fā)明的方法制備的傳感元件可W用于檢測(cè)食品中快喃挫酬及其代謝物。
[0019] 本發(fā)明的積極效果如下：
[0020] 本發(fā)明的方法制備的傳感元件可測(cè)定1X1(T3-1X102yg/mL濃度范圍內(nèi)快喃 挫酬及其代謝物A0Z，其他類似物的交叉反應(yīng)率均小于1%，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為AE= 0. 29311g(c)+l. 1079(R2 = 0. 998礦>)，檢出限約為 0. 0005yg/ml，回收率約 90% .同時(shí)，該 傳感元件變異性小，可保持40-50天，穩(wěn)定性好。由于該方法具有靈敏、方便、檢測(cè)時(shí)間短等 優(yōu)點(diǎn)，非常適用于樣品的早期篩選W及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明的基于納米氧化銅和單層分子膜的傳感元件檢測(cè)的原理的示意圖。
[0022] 圖2是各種修飾電極的循環(huán)伏安圖；
[0023] a.裸金電極；b.氧化銅納米/金電極；C.MPA氧化銅納米//金電極；d.A0Z抗體/ MPA氧化銅納米//金電極。
[0024] 圖3是不同CPAOZ濃度下響應(yīng)值A(chǔ)E的變化圖。
[0025] 圖4是CPAOZ電化學(xué)免疫傳感測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0027] 實(shí)施例1
[00測(cè) 1材料與方法
[0029] 1. 1儀器與試劑
[0030] CHI400系列電化學(xué)石英晶體微天平（上海辰華儀器有限公司），0.3ym和 0.05ymAl2〇3拋光打磨儀（上海辰華儀器有限公司），氮?dú)獯祾邇x（杭州奧盛儀器有限公 司），Z50達(dá)爾文納米粒度儀。AOZ多克隆抗體（本實(shí)驗(yàn)室制備）。硝酸銅、S琉基丙酸（MPA)、 碳二亞胺鹽酸鹽巧DC)、N-哲基硫代班巧亞胺（N服）、AOZ(AOZ，標(biāo)準(zhǔn)品），AOZ、CPAOZ、快喃 妥因、快喃它酬、快喃西林、2-硝基苯甲醒、對(duì)醒基苯甲酸等標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自阿拉了公司。磯 酸鹽緩沖液（PBS，pH7. 4)等其余試劑均為分析純，購(gòu)自杭州高晶精細(xì)化工有限公司。郵仁 購(gòu)自杭州下沙物美超市。
[0031] 1.2試驗(yàn)方法
[0032] 1. 2. 1基于納米氧化銅-琉基丙醇復(fù)合膜的傳感元件制備
[0033] (1)氧化銅納米材料的制備
[0034] 配制0.Imol/L的Cu(N03)2?&0溶液50血，向溶液中加入0.02mol/L的十二烷基橫 酸鋼溶液5mU攬拌，然后用2mol/L的氨氧化鋼溶液調(diào)節(jié)抑至10,將溶液置于75°C的水浴 環(huán)境中反應(yīng)12h，待反應(yīng)完成后將溶液離屯、分離，用蒸饋水和無水己醇分別洗漆沉淀3次， 產(chǎn)物在60°C下干燥化，即為納米氧化銅。用Z50達(dá)爾文納米粒度儀測(cè)定粒子的直徑分布。
[0035] (2)傳感元件制備
[0036] 依靠自組裝單層膜（SAMs)技術(shù)，利用琉基丙酸的琉基與沉積在金電極上的氧化 銅納米形成化-S鍵，其駿基與抗體偶聯(lián)，從而將抗體固定在金電極表面。具體方法如下： ①用0.1mol/LNaOH和0.1mol/L HN03分別淋洗金電極立次，每次Imin，再置于新鮮配制的 piranha溶液（30%&化：濃硫酸=1:3)，浸泡30min。②取出金電極，超純水淋洗Imin， 置于超純水中超聲清洗3min，無水己醇中超聲清洗3min。重復(fù)3次。⑨依次用0. 3 ym和 0. 05 jimAl2〇3粉末拋光至呈鏡面后，金電極置于piranha溶液，浸泡30min。重復(fù)步驟②， 高純氮吹干金電極表面。④用無水己醇溶解氧化銅納米成〇.5mg/mL。滴加適量氧化銅納 米己醇溶液于金電極上，用氮?dú)獯蹈珊蟮玫窖趸~納米/金電極；把金電極浸于MPA溶液 (0.1mol/L)中溫育12h，依次用超純水、無水己醇淋洗S次，每次Imin。高純氮吹干金電極 表面，即為MPA/氧化銅納米/金電極。然后將金電極浸于0.1mol/L N服和0.1mol/L邸C 的1:1混合液中1化后，用超純水淋洗3min。再將金電極浸于0. 3mg/mLA0Z抗體溶液（PBS， pH7. 4)，4°C過夜。最后用超純水小屯、清洗，高純氮吹干金電極表面，即為A0Z抗體/MPA/氧 化銅納米/金電極。
[0037] 1. 2. 2電化學(xué)表征
[003引 W CHI400傳感器，分別W裸金電極、氧化銅納米/金電極、MPA/氧化銅納米/金 電極和AOZ抗體/MPA/氧化銅納米/金電極為工作電極，WAg/AgCl電極為參比電極，W銷 絲電極為輔助電極，在0.OOlmol/LFe(CN)6^/^的PBS(pH7. 4)溶液中，進(jìn)行電位掃描，掃描 速度為lOmV/s，電位范圍為-0. 2~0. 6V。獲得各種金電極的循環(huán)伏安曲線。
[0039] 1. 2. 3電位響應(yīng)
[0040] 電化學(xué)免疫傳感器測(cè)定方法；W修飾有A0Z抗體的金電極為工作電極，WAg/AgCl 電極為參比電極，銷