正己烷預(yù)處理-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蠟中氯霉素殘留量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種測定蜂蠟中氯霉素殘留量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氯霉素（chloramphenicol,CA巧是一種高效廣譜的抗生素，對各種好氧和厭氧微 生物都有活性，被廣泛用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。但氯霉素對人類具有一定的毒性作用，如引起人的 粒細(xì)胞缺乏病，再生障礙性貧血和過敏等癥狀。FA0 /WA0規(guī)定食品中氯霉素的殘留不得檢 出，歐盟巧EC)96 / 23指令中把CAP列入禁用藥，并規(guī)定氯霉素MRPUminimumrequired performancelimits)值為 0. 3yg/kg。
[0003] 我國是世界養(yǎng)蜂大國，也是蜂產(chǎn)品生產(chǎn)及出口大國，2013全年蜂蠟總產(chǎn)量約8000 噸。蜂蠟是一種由工蜂腹部下面四對蠟腺分泌的物質(zhì)，其主要成分是燒醇和燒酸形成的醋 類等，在化妝品、食品和醫(yī)藥工業(yè)上應(yīng)用廣泛。然而，蜂農(nóng)在養(yǎng)殖蜜蜂過程中噴灑氯霉素藥 物用于預(yù)防和治療蜜蜂疾病，造成蜂蠟中氯霉素殘留。由于蜂蠟的循環(huán)使用導(dǎo)致蜂蠟中氯 霉素殘留量不斷增加，同時(shí)，通過蜜蜂與巢脾的接觸，氯霉素藥物殘留能夠轉(zhuǎn)移至蜂蜜、蜂 王漿、蜂膠等蜂產(chǎn)品中，進(jìn)而造成其他蜂產(chǎn)品污染。氯霉素在蜂蠟中的殘留不僅關(guān)系到人 體身體健康，也將對我國蜂蠟出口貿(mào)易產(chǎn)生巨大的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 近年來，國內(nèi)外有較多蜂蠟中殺菌劑等農(nóng)藥殘留檢測方法的報(bào)道，但尚未有蜂蠟 中氯霉素殘留量檢測方法的報(bào)道。由于蜂蠟的基質(zhì)復(fù)雜，無法采用國內(nèi)外已公布的檢測蜂 蜜、蜂王漿等蜂產(chǎn)品中氯霉素的方法進(jìn)行檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種正己燒預(yù)處理-高效液相色 譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蠟中氯霉素殘留量的方法，該法簡便、靈敏高、基質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn)，并 已用于蜂蠟樣品中痕量氯霉素殘留的定性和定量分析。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了W下的技術(shù)方案： 正己燒預(yù)處理-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蠟中氯霉素殘留量的方法，該方法包 括W下的步驟： 1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg置于100mL棟色容量瓶中，精確至0. 1mg，用甲醇溶解并定 容至刻度，混勻配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用甲醇配制成Img/L的單標(biāo)儲備液，根據(jù)實(shí) 際需要用流動性稀釋成相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；氯霉素-D5作為同位素內(nèi)標(biāo)的濃度為10 ng/mL;各種標(biāo)準(zhǔn)溶液避光保存于4 °C冰箱中； 2) 蜂蠟預(yù)處理 試樣可在70°C左右加熱條件下溶解并混勻； 3) 提取 稱取試樣2.0g于50血蓋離屯、管中，精確至0.01g，加入10血正己燒，禍旋超聲溶 解后加10mL水禍旋振蕩提取，8000r/min離屯、5min，取下層水層，待凈化； 4) 凈化 移取試樣提取液于OASISHLB固相凈化小柱中，OASISHLB固相凈化小柱使用前依次用 3血甲醇，5血水活化，棄去流出液，先用5血超純水淋洗，再用5血甲醇/水，甲醇/水 溶液的體積比為2/8,溶液淋洗小柱，棄去流出液，最后用5mL己酸己醋洗脫，收集洗脫液 于帶刻度離屯、管中，氮吹濃縮至近干，最后用甲醇/水溶液定容至1 111以混勻后經(jīng)0.22化 有機(jī)相濾膜過濾后用于上機(jī)分析； 5) 色譜條件 色譜柱；Ac州core化C18 柱，150mmX4. 6mm，4ym;柱溫；35°C;進(jìn)樣量；10uL;流 速；0. 5血/min;流動相；A為水溶液，B為甲醇溶液；梯度洗脫程序；0~0. 5min，70%A; 0. 5 ~7. 0min, 70〇/〇A~10〇/〇A;7. 0 ~8. 0min, 10〇/〇A;8. 0 ~8. 1min, 10〇/〇A~70〇/〇A;8. 1 ~ 12. 0min，70〇/〇A; 6) 質(zhì)譜條件 掃描方式：負(fù)模式掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)巧U(MRM);電噴霧電壓（Spray voltage) ;-3000V;銷氣（Sheathgaspressure) ;207kPa;輔助氣（Auxiliarygas flow) ;10arbitraryunits;毛細(xì)管溫度（CapillaryTemperature) ;350°C;蒸發(fā)溫度 (VaporizerTemperature) ;300°C;碰撞氣；氣氣（1. 5mtorr); 氯霉素和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件參數(shù)：
【主權(quán)項(xiàng)】
1.正己烷預(yù)處理-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蠟中氯霉素殘留量的方法，其特征 在于該方法包括以下的步驟： 1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于100 mL棕色容量瓶中，精確至0.1 mg，用甲醇溶解并定 容至刻度，混勻配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用甲醇配制成lmg/L的單標(biāo)儲備液，根據(jù)實(shí) 際需要用流動性稀釋成相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；氯霉素-D5作為同位素內(nèi)標(biāo)的濃度為10 ng/mL ;各種標(biāo)準(zhǔn)溶液避光保存于4 °C冰箱中； 2) 蜂蠟預(yù)處理 試樣可在70°C左右加熱條件下溶解并混勻； 3) 提取 稱取試樣2.0 g于50 mL蓋離心管中，精確至0.01 g，加入10 mL正己燒，禍旋超聲溶 解后加10 mL水禍旋振蕩提取，8000 r/min離心5min，取下層水層，待凈化； 4) 凈化 移取試樣提取液于OASIS HLB固相凈化小柱中，OASIS HLB固相凈化小柱使用前依次用 3 mL甲醇，5 mL水活化，棄去流出液，先用5 mL超純水淋洗，再用5 mL甲醇/水，甲醇/水 溶液的體積比為2/8,溶液淋洗小柱，棄去流出液，最后用5 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液 于帶刻度離心管中，氮吹濃縮至近干，最后用甲醇/水溶液定容至I mL，混勻后經(jīng)0.22 Mm 有機(jī)相濾膜過濾后用于上機(jī)分析； 5) 色譜條件 色譜柱：Accucore XL C18 柱，150 mmX4.6 mm，4 μπι;柱溫：35°C;進(jìn)樣量：10 yL;流 速：0. 5 mL/min ;流動相：A為水溶液，B為甲醇溶液；梯度洗脫程序：0~0. 5 min，70%A ; 0. 5 ~7. 0 min，70%A ~10%A ;7. 0 ~8. 0 min，10% A ;8. 0 ~8. I min，10%A ~70%A ;8. 1 ~ 12. 0 min，70%A ; 6) 質(zhì)譜條件 掃描方式：負(fù)模式掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM);電噴霧電壓（Spray voltage) :-3000 V ;鞘氣（Sheath gas pressure) :207 kPa ;輔助氣（Auxiliary gas flow) :10 arbitrary units;毛細(xì)管溫度（Capillary Temperature) :350 °C ;蒸發(fā)溫度 (Vaporizer Temperature) :30CTC ;碰撞氣：氬氣（I. 5mtor;r); 氯霉素和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件參數(shù)：
*定量離子； 7) 配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，0. 3、0· 5、1.5、3. 0、5. 0、10. 0 ng /mL，并 依次進(jìn)樣，分別以氯霉素的峰面積Y為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度值為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 結(jié)果表明，目標(biāo)物在〇.3~ 10 ng/mL范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性關(guān)系 方程為 Y=〇. 286385*X- 0. 00152397,相關(guān)系數(shù) R2大于 0. 998。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種正己烷預(yù)處理-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蠟中氯霉素殘留量的方法，該方法試樣采用正己烷預(yù)溶解形成乳濁液后加入水提取，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化，用Accucore XL C18柱分離，電噴霧離子源負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定。本發(fā)明優(yōu)化了提取、凈化方法和儀器測定條件等。結(jié)果表明：氯霉素在0. 3ng/mL-10ng/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.998。該方法定性限（S/N>3）為0.05 μg/kg，方法定量限（S/N>10）為0.3 μg/kg，在0.3μg/kg、1.0μg/kg和2.0μg/kg三個(gè)添加水平的回收率為80.2%-105.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）均小于8%。本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確。
【IPC分類】G01N30-88
【公開號】CN104880522
【申請?zhí)枴緾N201510209083
【發(fā)明人】雷美康, 彭芳, 徐佳文, 余琪, 祝子銅, 吳曉勤
【申請人】衢州出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年4月28日