一種Pt-氮化碳/石墨烯胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199生物傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種Pt-氮化碳/石墨烯胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199生物傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是采用Pt-氮化碳/石墨烯作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物，制備一種檢測(cè)胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199的生物傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]胰腺癌屬于消化系統(tǒng)的惡性度較高的腫瘤，近年來(lái)，胰腺癌的發(fā)病率有所增加，因而，早期診斷，早期治療非常重要。胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199主要存在于胃腸或胰腺癌患者的組織中，消化道腫瘤中的胰腺癌患者，血清中CA199含量明顯升高，對(duì)CA199的檢測(cè)有助于胰腺癌的早期診斷。
[0003]納米材料因其優(yōu)異的光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)、力學(xué)以及化學(xué)性質(zhì)，使其在生產(chǎn)、生活及科研中得到了廣泛地應(yīng)用。石墨烯納米層具有大的比表面積，催化性能好，生物相容性好，增強(qiáng)電子傳遞等優(yōu)點(diǎn)。Pt基催化劑對(duì)雙氧水具有較好的催化性能，被廣泛應(yīng)用于電池、傳感器等領(lǐng)域，Pt納米粒子和含有氮元素的材料結(jié)合能夠提高材料的活性。本發(fā)明將Pt-氮化碳/石墨烯復(fù)合材料作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物，提高生物傳感器的靈敏性，本發(fā)明構(gòu)建的傳感器具有選擇性好、靈敏高、檢測(cè)限低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，克服了放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法和試劑盒等方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是一種Pt-氮化碳/石墨烯胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199生物傳感器的制備。
[0005]本發(fā)明的目的之二是將該生物傳感器應(yīng)用于胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199的檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案
1.Pt-氮化碳/石墨稀的制備
(1)氧化石墨烯的制備
將0.3-0.6g石墨和1.8-3.6g高錳酸鉀加入500 mL的燒瓶中，將36~72 mL的H2SOjP4-8 mL的H3PCV混合后加入燒瓶中，50°C加熱回流12 h，將混合物倒在40~80 mL冰上，加入0.6-2 mL的雙氧水，攪拌30 min，離心后，分別用0.2 mol/L的鹽酸、乙醇、乙醚洗滌，40°C下真空干燥，制得氧化石墨烯；
(2)聚吡咯/氧化石墨烯的制備
將5-10 g的CTAB溶解于80 mL、l mol/L的HNO3溶液中，在攪拌下，加入0.05-0.2 g氧化石墨稀，加熱到100°c下，加入0.2~1 g卩比略，持續(xù)加熱60 min，加入1~3 g過(guò)硫酸錢，反應(yīng)180 min，混合物經(jīng)離心、洗滌后，40°C下真空干燥，制得聚吡咯/氧化石墨烯；
(3)檢測(cè)抗體標(biāo)記物一Pt-氮化碳/石墨烯的制備
在氬氣的氣氛下，將聚吡咯/氧化石墨烯800°C煅燒2 h，制得氮化碳/石墨烯，將2~10mg氮化碳/石墨稀和1-3 mL、3 mg/mL的K2PtCl4/EG加入到10 mL EG中，超聲0.5 h，隨后加入5?10 mL EG和0.2 mL、2 mol/L的NaOH/EG，在功率為300 W下，微波反應(yīng)110 S，混合物經(jīng)過(guò)離心、洗滌后，60°C下真空干燥，制得Pt-氮化碳/石墨烯。
[0007]2.檢測(cè)抗體孵化物一Pt-氮化碳/石墨烯-Ab2溶液的制備
將1~5 mg的Pt-氮化碳/石墨稀分散于I mL超純水中，與I mL、5~12 μ g/mL的檢測(cè)抗體溶液混合，在4°C下振蕩孵化12 h，離心分離，將下層沉淀分散于I mL、l/15 mol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中，制得檢測(cè)抗體孵化物一Pt-氮化碳/石墨烯-Ab2溶液，40C下保存?zhèn)溆谩?br>[0008]3.一種Pt-氮化碳/石墨烯胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199生物傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉對(duì)玻碳電極拋光處理，用超純水清洗干凈;
(2)取6μ?,Ο.5-2 mg/mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷化石墨烯的溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；
(3)將6μ?、5~15 Pg/mL的胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199捕獲抗體Ab1-至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(4)滴加3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5~15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(5)滴加6μ?濃度為0.0001-30 ng/mL的胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199溶液至電極表面，
4°C下晾干，超純水沖洗；
(6)將4~6μ?檢測(cè)抗體孵化物一Pt-氮化碳/石墨烯-Ab2S液滴至電極表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一種Pt-氮化碳/石墨烯胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199生物傳感器。
[0009]4.胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199的檢測(cè)方法
(1)采用電化學(xué)工作站的三電極體系進(jìn)行測(cè)定，將權(quán)利要求1所制備的免疫傳感器作為工作電極，飽和甘汞電極為對(duì)電極，鉑絲電極為輔助電極，在pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，米用時(shí)間_電流的方法進(jìn)行掃描，輸入電壓為_(kāi)0.4 V，運(yùn)行時(shí)間400 s ；
(2)在10mL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，對(duì)0.0001-30 ng/mL的胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)試，記錄電流變化，根據(jù)所得電流差值與胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199的濃度成線性關(guān)系，繪制工作曲線；
(3)將待測(cè)樣品溶液代替胰腺癌腫瘤標(biāo)志物CA199標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。
[0010]本發(fā)明的有益成果
(I)3-氨丙基三乙氧基硅烷化石墨烯具有較大的比表面積、良好的導(dǎo)電性以及良好的生物相容性和穩(wěn)定性，另外，3-氨丙基三乙氧基硅烷化石墨烯具有大量的氨基，不僅能夠提高其在水中的分散性，而且能夠結(jié)合大量的捕獲抗體，增加了傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。
[0011](2) Pt基催化劑對(duì)雙氧水具有較好的催化性能，被廣泛應(yīng)用于傳感器領(lǐng)域，Pt納米粒子和含有氮元素的材料結(jié)合能夠提高材料的活性。
[0012](3)本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器用于胰腺癌腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，響應(yīng)時(shí)間短，檢測(cè)限低，線性范圍寬，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、高靈敏和特異性檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1 Pt-氮化碳/石墨烯的制備
(1)氧化石墨烯的制備
將0.3 g石墨和1.8 g高錳酸鉀加入500 mL的燒瓶中，將36 mL的H2SOjP 4 mL的H3PCV混合后加入上述燒瓶中，50°C加熱回流12 h，將混合物倒在40 mL冰上，加入0.6 mL的雙氧水，攪拌30 min，離心后，分別用0.2 mol/L的鹽酸、乙醇、乙醚洗滌，40°C下真空干燥，制得氧化石墨稀;
(2)聚吡咯/氧化石墨烯的制備
將5 g的CTAB溶解于80 mL、l mol/L的HNO3溶液中，在攪拌下，加入0.05 g氧化石墨烯，加熱到100°C下，加入0.2 g吡咯，持續(xù)加熱60 min，加入I g過(guò)硫酸銨，反應(yīng)180 min,混合物經(jīng)離心、洗滌后，40°C下真空干燥，制得聚吡咯/氧化石墨烯；
(3)檢測(cè)抗體標(biāo)記物一Pt-氮化碳/石墨烯的制備
在氬氣的氣氛下，將聚吡咯/氧化石墨烯800°C煅燒2 h，制得氮化碳/石墨烯，將2 mg氮化碳/石墨稀和I mL、3 mg/mL的K2PtCl4/EG加入到10 mL EG中，超聲0.5 h，隨后加入
5mL EG和0.2 mL、2 mol/L的NaOH/EG，在功率為300 W下，微波反應(yīng)110 S，混合物經(jīng)過(guò)離心、洗滌后，60°C下真空干燥，制得Pt-氮化碳/石墨烯。
[0014]實(shí)施例2 Pt-氮化碳/石墨烯的制備
(1)氧化石墨烯的制備
將0.5 g石墨和3.0 g高錳酸鉀加入500 mL的燒瓶中，將60 mL的H2SOjP 6 mL的H3PCV混合后加入上述燒瓶中，50°C加熱回流12 h，將混合物倒在60 mL冰上，加入I mL的雙氧水，攪拌30 min，離心后，分別用0.2 mol/L的鹽酸、乙醇、乙醚洗滌，40°C下真空干燥，制得氧化石墨烯；
(2)聚吡咯/氧化石墨烯的制備
將6 g的CTAB溶解于80 mL、I mol/L的HNO3S液中，在攪拌下，加入0.1 g氧化石墨烯，加熱到100°C下，加入0.5 g吡咯，持續(xù)加熱60 min，加入2 g過(guò)硫酸銨，反應(yīng)180 min,混合物經(jīng)離心、洗滌后，40°C下真空干燥，制得聚吡咯/氧化石墨烯；
(3)檢測(cè)抗體標(biāo)記物一Pt-氮化碳/石墨烯的制備
在氬氣的氣氛下，將聚吡咯/氧化石墨烯800°C煅燒2 h，制得氮化碳/石墨烯，將5 mg氮化碳/石墨烯和2 mL、3 mg/mL的K2PtCl4/EG加入到10 mL EG中，超聲0.5 h，隨后加入7 mL EG和0.2 mL、2 mol/L的Na0H/EG，在功率為300 W下，微波反應(yīng)110 S，混合物經(jīng)過(guò)離心、洗滌后，60°C下真空干燥，制得Pt-氮化碳/石墨烯。
[0015]實(shí)施例3 Pt-氮化碳/石墨烯的制備
(1)氧化石墨烯的制備
將0.6 g石墨和3.6 g高錳酸鉀加入500 mL的燒瓶中，將72 mL的H2SOjP 8 mL的H3PCV混合后加入上述燒瓶中，50°C加熱回流12 h，將混合物倒在80 mL冰上，加入2 mL的雙氧水，攪拌30 min，離心后，分別用0.2 mol/L的鹽酸、乙醇、乙醚洗滌，40°C下真空干燥，制得氧化石墨烯；
(2)聚吡咯/氧化石墨烯的制備
將10 g的CTAB溶解于80 mL、I mol/L的圓03溶液中，在攪拌下，加入0.2 g氧化石墨稀，加熱到100°c下，加入I gP比略，持續(xù)加熱60 min，加入3 g過(guò)硫酸錢，反應(yīng)180 min,混合物經(jīng)離心、洗滌后，40°C下真空干燥，制得聚吡咯/氧化石墨烯；
(3)檢測(cè)抗體標(biāo)記物一Pt-氮化碳/石墨烯的制備
在氬氣的氣氛下，將聚吡咯/氧化石墨烯800°C煅燒2 h，制得氮化碳/石墨烯，將10mg氮化碳/石墨稀和3 mL、3 mg/mL的K2PtCl4/EG加入到10 mL EG中，超聲0.5 h，隨后加Λ 10 mL EG和0.