一種檢測抵抗素的試劑盒及其制備方法和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫分析領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種檢測抵抗素的試劑盒及其制備方法和 檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抵抗素（resisting,RST)是2001年發(fā)現(xiàn)的一種白色脂肪細(xì)胞特異表達(dá)和分泌 的激素蛋白。因它有降低膜島素敏感性的作用，故將其命名為抵抗素，它屬于抵抗素樣分 子家族（resistin-likemolecules,RELMs)分泌型蛋白質(zhì)家族成員。人類抵抗素是一種 12. 5kDa的蛋白質(zhì)，其前體含有108個(gè)氨基酸，其在人體內(nèi)細(xì)胞中合成后，被分泌到血液中。 抵抗素具有類似炎癥因子的蛋白分子結(jié)構(gòu)，與單核巨瞻細(xì)胞的功能有關(guān)，能影響多形核白 細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)和氧化爆發(fā)，導(dǎo)致患者免疫功能素亂，在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，此 夕F，有研究顯示，且抵抗素水平與體重指數(shù)和內(nèi)臟脂肪含量正相關(guān)，通常情況下通過檢測抵 抗素的水平來檢測脂肪在人體內(nèi)的沉積情況。
[000引在正常情況下，其在人體血液中的含量很低，一般小于14ng/mU而在消化性潰瘍 急性穿孔患者、潰瘍性結(jié)腸炎或肥胖患者血液中抵抗素的水平較高，約為l00-3(K)ng/ml。通 過檢測W急癥腹痛為主訴的患者血清中抵抗素的水平可W實(shí)現(xiàn)對消化性潰瘍急性穿孔、潰 瘍性結(jié)腸炎及肥胖等疾病的早期診斷和排查，為該類疾病的診斷治療提供數(shù)據(jù)支撐。
[0004] 目前，檢測抵抗素的方法主要有膠乳增強(qiáng)免疫比濁法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)巧LISA) 等。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法存在檢測線性范圍窄、陽性率低等缺點(diǎn)；ELISA法存在靈敏度低、 線性范圍窄、不易實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化等缺陷；從而限制了推廣使用，無法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷 和科研工作。目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)因其有上述諸多優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的；本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種檢測抵抗素的定量檢測試劑盒，具有 簡便、快速、靈敏度高、線性范圍寬和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，W克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述檢測抵抗素的試劑盒的制備方法和檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的第S個(gè)目的是提供了檢測抵抗素的試劑盒的檢測方法。
[000引本發(fā)明采用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)對人血清中抵抗素的水平進(jìn)行定量檢測，實(shí)現(xiàn) 對消化性潰瘍急性穿孔、潰瘍性結(jié)腸炎及肥胖等疾病的早期診斷和排查。
[0009] 技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測抵抗素的試劑盒，所 述試劑盒包括抗異硫氯酸巧光素多克隆抗體包被的磁微粒，異硫氯酸巧光素標(biāo)記的抵抗素 單克隆抗體，堿性磯酸酶標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體和堿性磯酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物 液。
[0010] 作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括用于稀釋所述抗異硫氯酸巧光素多克隆抗體包被的 磁微粒、異硫氯酸巧光素標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體和堿性磯酸酶標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體 的稀釋液，所述稀釋液為抑值為7. 5~8. 5、含質(zhì)量比為0. 3~0. 7%的牛血清白蛋白BSA 和0.05~0.3%的疊氮化鋼防腐劑NaN3的0.05~0.2MTris-HCl緩沖液。
[0011] 作為優(yōu)選，所述抗異硫氯酸巧光素多克隆抗體包被的磁微粒懸浮于稀釋液中，配 制成0. 5~2yg/mL的磁微粒溶液。
[0012] 在實(shí)際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了 檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，所W從復(fù)雜的待測樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測物是臨床 檢驗(yàn)工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的 磁性固相微粒作載體，W物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗 原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡單、不影響被分離細(xì) 胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場作用下可定向運(yùn)動(dòng)，使得某些 特殊成分得W分離、濃集或純化。作為優(yōu)選，所述磁微粒為0. 7~3ym粒徑、四氧化=鐵內(nèi) 核、表面包裹有活性基團(tuán)的聚合物。優(yōu)選地，所述活性基團(tuán)為駿基。
[0013] 作為優(yōu)選，所述異硫氯酸巧光素標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體溶解在稀釋液中，配制 成0. 25~0. 5yg/mL異硫氯酸巧光素標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體溶液。
[0014] 作為優(yōu)選，所述堿性磯酸酶標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體溶解在稀釋液中，配制成 0. 25~0. 5yg/mL堿性磯酸酶標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體溶液。
[0015] 作為優(yōu)選，所述化學(xué)發(fā)光底物液是0. 1~0. 3M，pH值為8~10的Tris-HCl緩沖 液，并含有0. 2~0. 4mg/mL的二氧雜環(huán)己燒。
[0016] 更為優(yōu)選的是，所述化學(xué)發(fā)光底物液是0. 2M，抑值為9. 3的Tris-HCl緩沖液，并 含有0. 3mg/mL的二氧雜環(huán)己燒。
[0017] 作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括清洗液，所述清洗液為0. 1~0. 2M，抑值為8~9的 Tris-HCl緩沖液中加入質(zhì)量百分比為0. 01~0. 04%的吐溫20和15~20%的氯化鋼。
[0018] 更為優(yōu)選的是，所述清洗液為0. 1M，抑值為8的Tris-HCl緩沖液中加入質(zhì)量百 分比為0. 02%的吐溫20和15%的氯化鋼。
[0019] 作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括抵抗素系列校準(zhǔn)品，所述校準(zhǔn)品濃度范圍為0~ 50ng/mL。
[0020] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的試劑盒還包括反應(yīng)試管，其材料選自透明的聚苯己締、聚 己締和聚丙締中的至少一種。
[0021] 本發(fā)明提供的試劑盒的檢測原理為；將待測樣本，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體 溶液和ALP標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體溶液混合溫育，巧光素（FITC)和堿性磯酸酶（AL巧標(biāo) 記的一對抗抵抗素單克隆抗體與樣本中抵抗素抗原分子結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。然后加入 包被有抗FITC多克隆抗體的磁微粒，免疫復(fù)合物被吸附到磁微粒表面。洗漆去除未結(jié)合的 抗體和雜質(zhì)后加入發(fā)光底物，ALP催化底物發(fā)光，測定相對發(fā)光強(qiáng)度（RLU)。在一定范圍內(nèi) RLU與抵抗素抗原濃度呈正比，通過內(nèi)插法就可W從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取待測樣本的抵抗素含 量。
[0022] 一種檢測抵抗素的試劑盒的檢測方法，包括W下步驟：
[0023] 1)將試劑盒中的試劑從儲(chǔ)存條件下取出后應(yīng)平衡到室溫再用于檢測；使用前將 抗FITC多克隆抗體包被的磁微粒溶液徹底混勻，確保磁微粒懸浮均勻；用去離子水將清洗 液稀釋，混勻；設(shè)定好37°C水??；使化學(xué)發(fā)光檢測儀處于待測狀態(tài)；根據(jù)需要準(zhǔn)備試管并做 好標(biāo)記；
[0024] 2)加校準(zhǔn)品和待測樣本至對應(yīng)試管中，加FITC標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體溶液和 ALP標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體溶液至每一試管中，用多管混勻器振蕩混勻，置37 + 0. 5°C水 浴，然后加入抗FITC多克隆抗體包被的磁微粒溶液至每一試管中，用多管混勻器振蕩混 勻，置37 + 0. 5°C水浴，試管連架放至磁分離器上，確保試管與磁板接觸，沉淀；用一大而緩 慢的圓周運(yùn)動(dòng)倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，拍擊，W 除去沾在管壁上的液滴，加稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器振蕩混勻；重復(fù)上 述清洗操作，共清洗3次；
[002引如加堿性磯酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液至每一試管中，混勻，在5分鐘內(nèi)用 發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測，利用四參數(shù)邏輯擬合得到校準(zhǔn)品劑量-反應(yīng)曲線的回歸方程，再根 據(jù)待測樣本的相對發(fā)光強(qiáng)度可W從回歸曲線上返算出樣本中待測物的濃度。
[0026] 有益效果；本發(fā)明提供的檢測抵抗素的試劑盒采用雙抗體夾屯、法的反應(yīng)模式，有 效地利用了化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)結(jié)合磁微粒免疫分離技術(shù)原理，定量測定人體血樣品中的抵 抗素含量，確保了檢測的靈敏度，且各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到同類進(jìn)口試劑盒的分析法水平。而且， 對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單可靠，可快速、高通量檢測大批樣品，便于操 作和生產(chǎn)。本發(fā)明提供的試劑盒結(jié)構(gòu)簡便，使用方便，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測范圍寬，操 作簡單，試劑盒成本低，無放射性污染，臨床適用性強(qiáng)，更適用于我國臨床檢測，適合在國內(nèi) 的各級醫(yī)院推廣使用。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例試劑盒中抵抗素的濃度一發(fā)光值曲線圖；
[002引圖2為本發(fā)明實(shí)施例A，B點(diǎn)連點(diǎn)擬合曲線圖（單位；ng/ml)。
[0029]
【具體實(shí)施方式】
[0030] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照 附圖，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0031] 實(shí)施例1檢測抵抗素的試劑盒的制備
[0032] 一、抵抗素校準(zhǔn)品的制備
[003引用抑=7. 5,0. 1MTris-HCl緩沖液將抵抗素純品稀釋成6個(gè)水平的凍干校準(zhǔn)品， 用純水復(fù)溶后的目標(biāo)濃度分別為0、0.25、2、10、25和50ng/ml。其中，所述抵抗素校準(zhǔn)品的 原料為標(biāo)準(zhǔn)級，純度不低于99 %。
[0034] 二、抗異硫氯酸巧光素（FITC)多克隆抗體包被的磁微粒溶液的制備
[0035] 將粒徑為1ym的磁微粒加磁場，靜置15min，倒出上清液，用抑=4. 7的25mM的 MES緩沖液清洗3次，并用該緩沖液進(jìn)行懸浮，濃度為50mg/mL;每血懸浮液中加入抗FITC 多克隆抗體2mg，在室溫條件下混合均勻；用去離子水配制濃度為lOmg/mL的l-(3-二甲 氨基丙基）-3-己基碳二亞胺巧DC)溶液，每血磁微粒懸浮液中加入ImL濃度為lOmg/mL 的邸C溶液，在室溫條件下攬拌反應(yīng)4小時(shí)后得到包被抗FITC多克隆抗體的磁微粒；然后 加磁場，靜置15min，倒出上清液，用抑=8. 0,含質(zhì)量比為0. 5%的牛血清白蛋白炬SA)和 0. 2%的疊氮化鋼防腐劑的0. 1MTris-HCl緩沖液清洗4次，并用該緩沖液將包被抗FITC 多克隆抗體的磁微粒配制成1yg/mL的工作液。該包被抗FITC多克隆抗體的磁微粒溶液 在4°C保存，不應(yīng)凍存，用時(shí)混勻。磁微粒為0. 7ym粒徑、四氧化=鐵內(nèi)核、表面包裹有活性 基團(tuán)的聚合物；活性基團(tuán)為駿基。
[0036]=、異硫氯酸巧光素（FITC)標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體溶液的制備
[0037] 將抵抗素單克隆抗體置于透析袋，在用0. 2MpH=9. 0的碳酸鹽緩沖液中過夜透 析；用0. 2M抑=9. 0的Na肥〇3溶液配制濃度為0. 5mg/mL的FITC溶液，每mg抵抗素單 克隆抗體加入0. 15mL濃度為0. 5mg/mL的FITC溶液，混合均勻，室溫下反應(yīng)20小時(shí)后，在 0. 2MpH=9. 0的碳酸鹽緩沖液中過夜透析，即得到異硫氯酸巧光素標(biāo)記的抵抗素單克隆 抗體；用含有質(zhì)量百分含量為0. 5%的牛血清白蛋白和質(zhì)量百分含量為0. 2%的疊氮化鋼 防腐劑的0. 1M Tris-HCl緩沖液稀釋異硫氯酸巧光素標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體，得到濃度 為0. 5 y g/mL的異硫氯酸巧光素標(biāo)記的抵抗素單克隆抗體溶液。
[003引四、堿性磯酸酶（AL巧標(biāo)記的抵抗素單克隆抗