此可以更容易地收集片段。此外，根據(jù)一個實施方式，可以使用脈沖激光來切割生化分子與微陣列基板之間的連接物和生化分子等。
[0047]脈沖激光具有1nm ?10，OOOnm,優(yōu)選 20nm ?5，OOOnm,更優(yōu)選 10nm ?2，OOOnm
的波長。在包括可見光譜的范圍內(nèi)，電磁場對光學(xué)組件沒有太大影響，能量可以透射至微陣列基板。此外，由于大多數(shù)商業(yè)脈沖激光在該范圍內(nèi)運(yùn)行，可以容易地實現(xiàn)該系統(tǒng)，并且當(dāng)使用利用犧牲層的基板時，可以無需進(jìn)行顯著的系統(tǒng)改造即可執(zhí)行本發(fā)明公開的技術(shù)。
[0048]脈沖激光可以具有Ias?1ms，優(yōu)選Ifs?10ns的脈沖持續(xù)時間。通過施加脈沖持續(xù)時間，當(dāng)發(fā)生因脈沖激光導(dǎo)致的脈沖激光燒蝕時行進(jìn)途徑會更固定，因此可以更容易地進(jìn)行收集。此外，通過施加脈沖持續(xù)時間，當(dāng)發(fā)生脈沖激光燒蝕時，可以降低對微陣列基板上生化分子的傷害，由此當(dāng)進(jìn)行所分離生化分子的后處理時，可以增加效率。
[0049]從微陣列基板分離所需簇的步驟包括將所需簇移動至儲器的工序。移動工序是貯存所分離生化分子以及必須與其他反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)時使用所述分子所需的工序。儲器可以包括制造成引起物理或化學(xué)反應(yīng)或制造成觀察所述反應(yīng)的容器。此外，儲器可以包括制造成貯存生化分子的容器。儲器具有IaL?1L，優(yōu)選IfL?10mL，更優(yōu)選IpL?500 μ L的體積，并且此類體積對應(yīng)于其中通過生化反應(yīng)分離的生化分子的后處理可以最容易地進(jìn)行的反應(yīng)體積。此外，儲器可以例如具有微孔陣列結(jié)構(gòu)，其中各個孔的體積為IpL ~ I μ L[David K.Wood 等，Single cell trapping and DNA damage analysis usingmicrowell arrays, PNAS (2010)]，從而通過減少所分離生化分子的化學(xué)反應(yīng)過程中的反應(yīng)體積而使試劑的浪費(fèi)最小化。此外，通過使用微孔陣列結(jié)構(gòu)，可以改善在某些反應(yīng)中的反應(yīng)速率和效率。
[0050]以將所述簇部分或全部地轉(zhuǎn)移至至少一個儲器的方式進(jìn)行從微陣列基板分離所需簇的步驟。通過分離一部分所述簇，對應(yīng)的生化分子可以使用至少一次，因此，可以減少所合成生化分子的數(shù)量。此外，可以從一個儲器分離多種所需簇，因此，可以引起生化分子之間的化學(xué)反應(yīng)。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的微陣列基板上的生化分子的分離方法還可以包括在分離步驟后擴(kuò)增從微陣列基板分離的所需簇的步驟。存在于通常微陣列基板上的生化分子的量對于在通常使用的儲器(其單位為yL)中進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)可能是不足的。因此，根據(jù)生化分子的目的，可以通過在分離步驟后進(jìn)行擴(kuò)增步驟而拓展所分離生化分子的應(yīng)用范圍。所需簇可以優(yōu)選是核酸，因為與其他生化分子或經(jīng)由生化分子附著的其他文庫相比，核酸的擴(kuò)增更容易和更經(jīng)濟(jì)。擴(kuò)增的核酸優(yōu)選是DNA或RNA。DNA或RNA可以通過諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等使用聚合酶的方法、體外轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、線性擴(kuò)增、多重置換擴(kuò)增(MDA)、細(xì)胞內(nèi)融合、細(xì)胞內(nèi)克隆或其組合進(jìn)行擴(kuò)增。
[0052]根據(jù)本發(fā)明一個實施方式的微陣列基板上的生化分子的分離方法還可以包括將從微陣列基板分離的所需簇或其化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物測序，或者將其用于基因合成。所需簇可以是核酸，優(yōu)選DNA?；瘜W(xué)反應(yīng)產(chǎn)物可以是擴(kuò)增的生化分子，優(yōu)選擴(kuò)增的核酸，更優(yōu)選擴(kuò)增的DNA0
[0053]可以使用所分離的生化分子或分離后擴(kuò)增的生化分子來制備用于靶向測序以及外顯子組測序或全外顯子組測序(WES)的捕獲探針。所分離的生化分子或分離后擴(kuò)增的生化分子優(yōu)選是DNA或RNA。例如，當(dāng)DNA分子存在于微陣列上時，可以分離并擴(kuò)增所述DNA分子，并且將所擴(kuò)增的DNA分子與gDNA通過轉(zhuǎn)錄等進(jìn)行雜交，可以僅選擇性地收集特定序列，通過分析所收集的序列，可以有效地進(jìn)行靶測序或外顯子組測序。具體而言，由于各個捕獲探針是分開的，因此可以通過控制各個探針的濃度而有意地控制捕獲效率。如果存在于微陣列上的DNA分子的量是足夠的，可以無需擴(kuò)增即可進(jìn)行雜交后的工序。
[0054]可以使用擴(kuò)增、連接、組裝PCR、等溫組裝[Daniel G Gibson等，Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods6，343-345 (2010)]，和成對組裝[William J.Blake 等，Pairwise select1n assemblyfor sequence-1ndependent construct1n of long-length DNA,核酸 Research38，2594-2602(2010)]等的至少一種將分離的核酸組裝到基因中。
[0055]圖2是圖示根據(jù)本說明書中公開的一個實施方式的分離方法的示意圖。(a)表示微陣列基板上合成的不同種類的生化分子。將生化分子通過共價鍵或吸附等固定在微陣列基板上。如(b)中所示，當(dāng)將脈沖激光通過聚光器或透鏡照射至微陣列基板的所需位置時，發(fā)生脈沖激光燒蝕或照射壓力排出，因此一部分微陣列基板從整個基板上分離。結(jié)果，分離的微陣列基板掉向儲器，并且因為對應(yīng)于所需位置的生化分子固定在分離的基板上，可以將所需生化分子分離至儲器中。在(C)中表示的其他所需生化分子的情況下，也可以進(jìn)行(b)。
[0056]圖3圖示根據(jù)本說明書中公開的一個實施方式的微陣列基板上的生化分子的分離方法。參照圖3(a)，可以將一種生化分子全部分離到儲器中。此外，參照(b-Ι)和(b-2)，可以將相同的生化分子如上所述分離到不同儲器中。通過部分地分離所述簇，相關(guān)的生化分子可以使用至少一次，因此，可以減少所合成生化分子的數(shù)量。此外，多種生化分子可以如(c)所圖示的那樣同時分離到一個儲器中或者如(d-Ι)和(d-2)所述通過時間間隔進(jìn)行分離。通過將多種所需簇分離到一個儲器中，可以引起生化分子間的化學(xué)反應(yīng)。
[0057]根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，提供用于在微陣列上分離生化分子的系統(tǒng)。圖4是圖示根據(jù)本說明書中公開的一個實施方式的用于在微陣列上分離生化分子的系統(tǒng)的示意圖。本發(fā)明提出的該系統(tǒng)包括:配備有微陣列基板的載臺，所述微陣列基上板附著有根據(jù)各斑點單元而分類的不同種類的生化分子的簇，所述各個斑點規(guī)則地布置在微陣列基板上；提取裝置，所述提取裝置用于以接觸或非接觸的方式施加能量，從而從所述微陣列基板上分離所述生化分子的簇中的所需簇；和控制裝置，所述控制裝置用于將所述微陣列基板的特定區(qū)域定位以使所述區(qū)域?qū)?yīng)于所述提取裝置，從而分離所需簇。
[0058]根據(jù)一個實施方式，提取裝置可以包括脈沖激光光源和聚光器。聚光器優(yōu)選是用于收集脈沖激光能量并且同時用于將微陣列基板成像的光學(xué)透鏡。脈沖激光可以準(zhǔn)確地在所需時間點照射至基板上待分離的斑點，這通過使用諸如通常的計算機(jī)等控制裝置控制脈沖激光發(fā)射而進(jìn)行。光學(xué)透鏡可以具有2X?100X，優(yōu)選1X?40X的放大率。通過使用該放大率，適于分離的能量可以透射至微陣列基板并且防止透鏡和微陣列基板相互接觸，或防止脫離焦距。
[0059]根據(jù)一個實施方式，在微陣列上分離生化分子的系統(tǒng)中，載臺、提取裝置和控制裝置中的至少一個可以以Imm以下、優(yōu)選100 μπι以下、更優(yōu)選5 μπι以下的精度操縱。由于大多數(shù)微陣列中斑點之間的間隔為5 μπι?100 μπι，在大多數(shù)微陣列中以5 μπι以下的精度操縱的載臺、提取裝置和控制裝置可以準(zhǔn)確地分離所需簇。
[0060]根據(jù)一個實施方式，所述系統(tǒng)還包括用于觀察微陣列基板以分離所需簇的成像裝置。成像裝置可以由光學(xué)透鏡、光源和圖像傳感器中的至少一個組成。光學(xué)透鏡可以包括在提取裝置中，并且必要時，可以另外單獨地使用光學(xué)透鏡。
[0061]光源的波長可以是1nm?10，OOOnm,優(yōu)選50nm?2，OOOnm,更優(yōu)選10nm?l，500nm。在波長范圍內(nèi)，可以使用熒光或可見光最容易地觀察或測量微陣列。作為光源，例如可以使用鹵素?zé)簟?br>[0062]作為圖像傳感器，通常使用電荷耦合裝置(CXD)，但是本發(fā)明不限于此。在步驟S2中，獲得其中在微陣列基板上的所述生化分子的簇中的所需簇位于的個體位點的位置信息后，可以使用成像裝置來確認(rèn)所述斑點是否存在于所述位置中。此外，成像裝置可用于確認(rèn)在步驟S3中，用于施加能量的提取工具被準(zhǔn)確地定位，從而根據(jù)所述位置信息分離所需簇。此外，可以使用成像裝置來確認(rèn)在步驟S4中，從微陣列基板分離的所需簇是否存在于儲器內(nèi)。
[0063]根據(jù)一個實施方式，還可以包括裝備有用于收集分離的所需簇的儲器的單獨的載臺。載臺可以以Imm以下，優(yōu)選100 μπι以下，更優(yōu)選I μπι以下的精度操縱。配備有儲器的單獨的載臺可以有利于分離的生化分子的利用，并且具有Ium以下的精度的載臺可以將生化分子分離到具有IpL?I UL微孔陣列結(jié)構(gòu)的儲器中。
[0064]圖4圖示用于在微陣列上分離生化分子的系統(tǒng)的一個實施方式。所述系統(tǒng)分成上部系統(tǒng)和下部系統(tǒng)。上部系統(tǒng)通過計算機(jī)控制，并且由上部載臺(機(jī)動化XY載臺)，與其下部相連的微陣列基板、脈沖激光和上部成像裝置組成。
[0065]由遠(yuǎn)焦光學(xué)系統(tǒng)組成的上部系統(tǒng)可以通過光學(xué)透