糖原磷酸化酶同工酶bb近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種糖原磷酸化酶同工酶BB近紅外法熒 光檢測(cè)試劑盒及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)是一種心肌細(xì)胞中含量較高的酶。糖原磷酸化酶 為糖原分解的關(guān)鍵酶，在心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)構(gòu)成糖原分解復(fù)合物，該復(fù)合物對(duì)缺血引起的糖 原分解特別敏感，使其構(gòu)成發(fā)生改變，形成町溶性糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)，透過(guò)細(xì)胞 膜進(jìn)入血液。
[0003] 糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)對(duì)心肌缺血缺氧敏感，在心肌損傷早期（小于4h) 即可釋放入血，是急性心肌損傷早期診斷的一項(xiàng)很好的指標(biāo)。對(duì)急性心肌缺血的早期診斷 優(yōu)于心電圖，是目前發(fā)現(xiàn)的急性心肌梗死（AMI)病人胸痛發(fā)作后4h內(nèi)最敏感的指標(biāo)。GPBB 的這一特點(diǎn)在AMI的早期診斷方面彌補(bǔ)了cTnl的不足。隨著生物化學(xué)、免疫、分子生物學(xué) 及其檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)GPBB對(duì)缺血性心肌損傷的早期診斷、產(chǎn)科、兒科學(xué)等方面的研 宄頗具價(jià)值。
[0004] 常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELIsA)等檢測(cè)方法耗時(shí)、需要特殊設(shè)備，不適于急診 室和現(xiàn)場(chǎng)對(duì)AMI的快速診查的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種糖原磷酸化酶同工酶 BB近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒及其用途，用于建立高效可行的糖原磷酸化酶同工酶BB近紅 外熒光檢測(cè)技術(shù)，解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒結(jié)合近紅外熒光檢 測(cè)技術(shù)，可快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)出人全血/血清/血漿中糖原磷酸化酶同工酶BB。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的第一方面提供一種糖原磷酸化酶同工酶BB近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒， 包括位于背板上的試劑條，試劑條從加樣端開始依次為樣品墊、標(biāo)記有免疫熒光探針的玻 璃纖維素膜、包被有抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體的硝酸纖維素膜和吸水紙。
[0008] 優(yōu)選的，所述免疫熒光探針為抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體包被的近紅 外熒光乳膠微球顆粒。
[0009] 優(yōu)選的，硝酸纖維素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體和所述近 紅外熒光乳膠微球顆粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體可以為相同的抗糖 原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體，也可以為不同的抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體。
[0010] 更優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體為 Abeam?Anti-GPBB抗體[17B6]，所述近紅外焚光乳膠微球顆粒上包被的抗糖原磷酸化酶 同工酶BB單克隆抗體為Abeam?Anti-GPBB抗體[17B6]，或所述硝酸纖維素膜上包被的抗 糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體為Abeam?.Anti-GPBB抗體[17B6]，所述近紅外熒光 乳膠微球顆粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體為Abeam?Anti-GPBB抗體 [lG6]〇
[0011] 更優(yōu)選的，所述熒光乳膠微球顆粒的直徑為140-160nm。
[0012]近紅外光（NIR)，是介于可見光（VIS)和中紅外光（MIR)之間的電磁波，ASTM定義 NIR為波長(zhǎng)在780nm-2526nm范圍內(nèi)的電磁波。在近紅外光區(qū)，生物體自吸收或熒光強(qiáng)度很 小，可避免背景干擾。同時(shí)由于散射光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方呈反比，近紅外區(qū)的散射干擾大 為減少。
[0013] 本發(fā)明的第二方面提供所述糖原磷酸化酶同工酶BB近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒的 制備方法，包括如下步驟：
[0014] 1)用緩沖液將熒光乳膠微粒離心清洗并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒分 散液中加入抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體；加入EDCA使抗體與顆粒偶聯(lián)；再加入 封閉液封閉乳膠顆粒上多余的基團(tuán)，制備獲得探針溶液；
[0015] 2)將含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體的緩沖溶液噴加到硝酸纖維素膜 上，烘干備用；
[0016] 3)將步驟1)制備獲得的探針溶液浸潤(rùn)玻璃纖維薄膜，干燥備用；
[0017] 4)將步驟2)所得的硝酸纖維素膜、步驟3)所得的標(biāo)記有免疫熒光探針的玻璃 纖維素膜、樣品墊、吸水紙及背板組裝制備成糖原磷酸化酶同工酶BB近紅外熒光檢測(cè)試劑 盒。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，再加入封閉液封閉乳膠顆粒上多余的基團(tuán)，并加入冠醚， 制備獲得探針溶液，所述冠醚選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一種 或多種的組合。
[0019] 更優(yōu)選的，步驟1)制備獲得的探針溶液中冠醚的濃度為0.l-20mg/ml，更優(yōu)選為 4_8mg/ml〇
[0020] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，緩沖液為磷酸鹽（PBS)緩沖液。
[0021] 更優(yōu)選的，所述PBS緩沖液為0? 009-0. 011mol/L，PH7. 25-7. 35的PBS緩沖液。
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，熒光乳膠微粒的直徑為140-160nm。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，乳膠顆粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體、EDCA的 重量比為 9-11 :0? 9-1. 1 :0? 9-1. 1。
[0024] 在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，乳膠顆粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體、 EDCA的投料量分別為lmg、100ug、100ug。
[0025] 優(yōu)選的，所述封閉液為乙醇胺，加入量為適量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況調(diào) 整乙醇胺的用量。
[0026] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，所述緩沖溶液為PBS緩沖液。
[0027] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可選取適當(dāng)濃度和pH的PBS緩沖液，更優(yōu)選為0. 009-0.Ollmol/ L，PH7. 25-7. 35 的PBS緩沖液。
[0028]優(yōu)選的，所述步驟2)中，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體的緩沖溶液中 還含有冠醚，所述冠醚選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一種或多種 的組合。
[0029] 更優(yōu)選的，所述含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體的緩沖溶液中冠醚的 濃度為〇?l-20mg/ml，更優(yōu)選為4-8mg/ml。
[0030] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體的緩沖溶液中 抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體的濃度為1. 8-2. 2mg/ml。
[0031] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體的緩沖溶液的噴加 量為 0? 9-1.lul/cm。
[0032] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，烘干的具體條件為36_38°C烘箱烘干。
[0033] 所述噴加過(guò)程利用微量蛋白點(diǎn)膜系統(tǒng)。
[0034] 優(yōu)選的，所述步驟1)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體為Abeam? Anti-GPBB抗體[17B6]，所述步驟2)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體為Abeam? Anti-GPBB抗體[17B6]，或所述步驟1)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗體為 AAbeam?Anti-GPBB抗體[17B6]，所述步驟2)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB單克隆抗 體為Abeam?Anti-GPBB抗體[1G6]。
[0035] 優(yōu)選的，所述步驟3)中，干燥的具體條件為真空干燥機(jī)干燥。
[0036] 本發(fā)明的第三方面提供了所述糖原磷酸化酶同工酶BB近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒 在糖原磷酸化酶同工酶BB檢測(cè)領(lǐng)域的用途。
[0037] 所述用途具體為使用所述糖原磷酸化酶同工酶BB近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒對(duì)樣 品中的糖原磷酸化酶同工酶BB進(jìn)行檢測(cè)，所述樣品選自人全血、血清或血漿中的一種或多 種的組合。
[0038] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒以人全血/血清/血漿為檢測(cè)樣本，結(jié)合近紅外熒光 檢測(cè)技術(shù)，可快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)出患者標(biāo)本中的糖原磷酸化酶同工酶BB。所述試劑盒采用免 疫熒光層析法，其最小可測(cè)量可達(dá)〇. 6pg/ml，檢測(cè)方便、成本低，靈敏度高，特異性好，比同 類定量診斷試劑價(jià)格低20-30%，大大節(jié)約了社會(huì)醫(yī)療成本，檢測(cè)過(guò)程中樣品收集及處理簡(jiǎn) 單，可快速準(zhǔn)確的獲得結(jié)果，非常適合突發(fā)事件現(xiàn)場(chǎng)和基層使用，并可應(yīng)用到臨床檢測(cè)中， 為臨床治療提供定性依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0040] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一"和"這個(gè)"包括復(fù)數(shù)形式。
[0041] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0042] 除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見Sambrook 等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarbor LaboratoryPress，1989andThirdedition，2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLS INMOLECULARBIOLOGY,Johnffiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates； theseriesMETHODSINENZYMOLOGY,