測定血管性血友病因子活性的方法及檢測試劑盒的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明是申請日2008年7月3日、發(fā)明名稱為"在不存在瑞斯托霉素的情 況下測定血管性血友病因子活性的方法和測定ADAMTS-13蛋白酶的方法"、申請?zhí)枮?200880023579. 6的申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于凝血診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在樣本中測定血管性血友病因子（VWF) 活性的體外方法。所述方法包括對GPIba蛋白功能獲得性變異體的使用，這樣就可不使用 瑞斯托霉素、美洲矛頭腹毒蛋白或與瑞斯托霉素或美洲矛頭腹毒蛋白等效的其他物質(zhì)。本 發(fā)明還涉及一種測定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 血管性血友病因子（VWF)是血漿中的一種大分子多聚體糖蛋白，在初期止血過 程中具有重要作用。另外，VWF具有膠原蛋白結(jié)合位點和用于定位于血小板表面的糖蛋白 Ib(GPIb)的結(jié)合位點。GPIb是一種整合膜蛋白，會與另一種整合膜蛋白（糖蛋白IX(GPIX)) 在血小板膜中形成糖蛋白Ib-IX受體復(fù)合物。GPIb是雙鏈分子，由一條表觀分子質(zhì)量約為 145kDa的重鏈（同義詞：heavy chain、a鏈或GPIb a )和一條表觀分子質(zhì)量約為22kDa 的輕鏈（同義詞：light chain、|3鏈或GPIb|3 )構(gòu)成，這兩條鏈通過二硫鍵彼此相連 [Lopez, J. A?等人（1987)Cloning of the a chain of human platelet glycoprotein Ib:A transmembrane protein with homology to leucine-rich a 2-glycoprotein. Proc.Natl. Acad. Sci USA 84:5615-5619]。
[0004] 血管受傷時，VWF結(jié)合到暴露的膠原蛋白表面。由于與膠原蛋白結(jié)合以及受到增 大的剪力（作用在與膠原蛋白結(jié)合的VWF上）的影響，VWF發(fā)生變化或被激活，從而可以結(jié) 合到血小板膜的GPIb-IX受體復(fù)合物中的GPIb重鏈（GPIba)的氨基末端。經(jīng)激活的VWF 通過這種方式俘獲從旁邊經(jīng)過的血小板，使得受傷處形成由VWF、膠原蛋白和血小板構(gòu)成的 第一團聚體。隨后血小板被激活，從而開始血漿凝血過程，該過程在經(jīng)過復(fù)數(shù)次放大級聯(lián)反 應(yīng)和血小板進一步聚集后最終促成傷口的愈合。
[0005] VWF在質(zhì)或量上的異常是血管性血友?。ㄍx詞：von Willebrand Disease，VWD) 的起因，這種病是最常見的遺傳出血性疾病之一。就血管性血友病的診斷而言目前存在不 同的篩查方法，例如測定出血時間（BT)、測定VWF抗原濃度（VWF:Ag)的定量法（例如ELISA 方法）和測定VWF活性的方法（例如瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板凝集（VWF:RCo))。
[0006] 瑞斯托霉素誘導(dǎo)固定血小板聚集的方法（又稱"瑞斯托霉素輔因子檢測"）還能 識別VWF蛋白用測定VWF抗原濃度的定量法所識別不到的功能性缺陷。因此，為能對血管 性血友病做出完全診斷，有必要實施用于測定瑞斯托霉素輔因子活性的瑞斯托霉素輔因子 檢測。實施瑞斯托霉素輔因子檢測時通常是將患者的血漿樣本與固定的血小板混合和與瑞 斯托霉素混合。在斯托霉素的誘導(dǎo)下，樣本所含的VWF結(jié)合到所添加的血小板的GPIb受體 上，從而實現(xiàn)血小板的聚集。這一聚集反應(yīng)的反應(yīng)程度與患者樣本所含的被激活的VWF的 量有關(guān)。例如，這種聚集反應(yīng)可通過測量傳播增長進行光學(xué)檢測，從而實現(xiàn)VWF:RCo活性的 量化。
[0007] 與VWF抗原檢測相比，瑞斯托霉素輔因子檢測的優(yōu)點在于可對VWF進行活性測定， 從而實現(xiàn)對VWF功能性紊亂的識別，以及對血管性血友病的不同子類進行分類，這些子類 中僅部分子類也是隨VWF抗原濃度的降低而出現(xiàn)。一般情況下，對這些子類進行分類時須 形成VWF瑞斯托霉素輔因子活性（VWF:RCo)與VWF抗原濃度（VWF:Ag)的比率（Ratio)。對 于血管性血友病的子類2A、2B和2M而言，VWF:RCo/VWF:Ag之比通常小于1。通常建議將 〇. 7的比率作為極限值。
[0008] 傳統(tǒng)的瑞斯托霉素輔因子檢測的不足之處在于實施過程很難自動化，因為在測量 過程中需要不斷地充分攪拌檢測標本（Testansatz)中的血小板。此外，這種檢測的精確度 相對較低，對相關(guān)標準所規(guī)定的處于〇%至20%范圍內(nèi)的低VWF活性的測定無法充分發(fā)揮 作用。
[0009] 近來有人研發(fā)出了基于GPIba的VWF-ELISA檢測，這種檢測所使用的重組GPIba 片段（1-289 或 1-290)包含氨基末端 VWF 結(jié)合區(qū)[W001/02853A2 或 Vanhoorelbeke, K.等 人(2002)A reliable von ffillebrand factor:Ristocetin cofactor enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate between type land type 2von ffillebrand disease. Semin Thromb Hemost. 28 (2):161-165 以及 Federici, A. B?等人（2004)A sensitive ristocetin co-factor activity assay with recombinant glycoprotein lb a for the diagnosis of patients with low von ffillebrand factor levels. Heamatologica 89(1):77_85]。這些檢測方法借助特異性抗體將重組GPIba片段結(jié)合在 酶標板上。添加患者樣本和瑞斯托霉素，使得患者樣本中的VWF可以結(jié)合到重組GPIba片 段上。最后借助抗VWF抗體對結(jié)合的VWF進行定量檢測。結(jié)果表明，這種VWF-ELISA檢測 十分接近于基于血小板的傳統(tǒng)VWF瑞斯托霉素輔因子活性檢測，甚至比之更敏感、更精確。
[0010] Hui等人（摘要，ISTH 2007)所描述的基于GPIb a的VWF-ELISA檢測使用在位 置233和位置239上具有突變體的重組GPIba片段（1-483)。這些突變體是所謂的功能 獲得性突變體，它們在瑞斯托霉素濃度較低的情況下與野生型GPIba蛋白（W0 93/16712) 相比對VWF的親和性更高，可以更強烈地與VWF相互作用。上述突變體是眾所周知的 GPIba鏈突變變異體。Miller等人（US 5, 317, 097)描述的是GPIba鏈的位置233上 的甘氨酸殘基被纈氨酸殘基（G233V)取代的方法。這種變異是血小板型血管性血友病 (PT-VWD)的起因，PT-VWD是一種常染色體顯性遺傳出血性疾病。Russell和Roth描述的 是GPIba鏈的位置239上的甲硫氨酸殘基被纈氨酸殘基（M239V)取代的方法[Russell，S. D. &Roth, G. J. (1993)Pseudo-von ffillebrand Disease:A mutation in the platelet glycoprotein lb a gene associated with a hyperactive surface receptor.Blood 81 (7), 1787-1791]。這種變異也會引發(fā)PT-VWD。
[0011] 上述基于GPIba的VWF-ELISA檢測以及瑞斯托霉素輔因子檢測的缺點在于，它們 建立在使用瑞斯托霉素或其他可以促使VWF結(jié)合到GPIb a鏈上的外源非生理性調(diào)節(jié)因子 的基礎(chǔ)上。瑞斯托霉素是一種來自于諾卡氏菌屬的抗生糖肽，美洲矛頭腹毒蛋白（同義詞： 副凝集素（co-agglutinin))是一種來自于矛頭腹屬的蛇毒，它們通常用于體外誘導(dǎo)VWF結(jié) 合到血小板或結(jié)合到分離GPIba蛋白或其片段上。使用瑞斯托霉素的缺點是，它不僅會結(jié) 合到VWF上，還會結(jié)合到許多其他類型的蛋白上，例如纖維蛋白原或抗GPIba抗體（在特 定的實驗中觀察到的）。因此，在VWF檢測方法中使用瑞斯托霉素存在發(fā)生非特異性結(jié)合反 應(yīng)或沉淀反應(yīng)的風(fēng)險，這些反應(yīng)會使檢測結(jié)果失真。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種在不存在瑞斯托霉素的情況下測定VWF活性的方 法。
[0013] 基于人類GPIba受體氨基酸序列，通過位置233和位置239上具有兩處點突變的 GPIba鏈的功能獲得性變異體來實現(xiàn)本發(fā)明的目的。在本發(fā)明范圍內(nèi)，GPIba鏈的功能獲 得性變異體指的是一種在瑞斯托霉素濃度較低的情況下與野生型GPIb a蛋白相比對VWF 的親和性明顯更高、可以更強烈地與VWF相互作用的突變變異體。
[0014] 本發(fā)明的標的是一種在樣本中測定血管性血友病因子（VWF)活性的方法，其中， 將所述樣本和分離GPIb a蛋白混合成一檢測標本，該檢測標本中不添加瑞斯托霉素和美 洲矛頭腹毒蛋白。所用的GPIb a蛋白包括一種氨基酸序列，所述氨基酸序列與人類GPIb a 蛋白的野生型序列相比至少包含氨基酸殘基1-268,且分別在位置233和239上具有一種取 代基Xaa(SEQID NO:l)。GPIba鏈位置233上的甘氨酸殘基取代基Xaa和位置239上的甲 硫氨酸殘基取代基Xaa優(yōu)選由一種纈氨酸殘基（G233V或M239V)或一種絲氨酸殘基（G233S 或M239S)構(gòu)成。這兩個位置上的不同取代基Xaa可以為任意一種組合。在對本發(fā)明進行 說明時，提及GPIb a蛋白時均可理解是指這樣一種突變變異體。
[0015] 此外，優(yōu)選不在所述檢測標本中添加"瑞斯托霉素或美洲矛頭腹毒蛋白的等效物 質(zhì)"。在本發(fā)明范圍內(nèi)，"瑞斯托霉素或美洲矛頭腹毒蛋白的等效物質(zhì)"是指可以體外誘導(dǎo)分 離VWF結(jié)合到野生型GPIb a鏈或其片段上的外源（即非生理性）物質(zhì)。
[0016] 本發(fā)明的一個優(yōu)點在于，通過使用GPIba的功能獲得性變異體，就無需通過（例 如）流體流動、攪拌或振動來對檢測標本施加抗剪應(yīng)力。
[0017] 就VWF活性測定方法而言，"樣本"指的是有可能含有待檢測物質(zhì)（即VWF)的材 料。例如，"樣本"這一概念包括特別是人和動物的生物液體（如血液、血漿或血清）以及 用于血管性血友病患者替代療法的工業(yè)產(chǎn)品（如Haemate?P)，如VWF定標劑、VWF質(zhì)控 血漿（VWF-Kontrolle)或高濃度VWF濃縮物。必要時須對樣本進行預(yù)處理，以便可以檢測 到被分析物或?qū)⒏蓴_性的樣本成分移除。這種樣本預(yù)處理可以包括分離和/或溶解細胞或 對樣本的離心分離。"樣本"這一概念還包括包含上述樣本材料中的一種樣本材料的反應(yīng)混 合物，該樣本材料中被加入用作基質(zhì)的分離VWF，以便測定VWF改性因子的活性，在培養(yǎng)VWF 基質(zhì)后需要借助VWF改性因子在這類反應(yīng)混合物中測定殘留VWF活性。例如，由血漿樣本 和分離大分子VWF構(gòu)成的用于測定該血漿樣本中的VWF裂解ADAMTS-13蛋白酶的混合物就 是這樣一種反應(yīng)混合物。血漿樣本中的ADAMTS-13蛋白酶裂解所添加的VWF基質(zhì)，從而降 低該樣本的VWF活性。
[0018] 本發(fā)明的方法所用的GPIb a鏈可以是用重組法或合成法制成的GPIb a蛋白。已 知的原核或真核表達系統(tǒng)適合用來制造重組GPIba蛋白，例如在細菌（如大腸桿菌）中表 達，在酵母（如釀酒酵母、甲醇酵母）中表達，在植物、動物或人類細胞培養(yǎng)中表達。已知的 體外蛋白合成技術(shù)適合用來制造合成GPIb a蛋白，例如固相合成（例如Merrifield合成 法）。本發(fā)明的方法所用的GPIba蛋白優(yōu)選是一種用重組法在人類細胞培養(yǎng)物（優(yōu)選人胚 腎細胞（HEK細胞）培養(yǎng)物）中制成的GPIb a蛋白。
[0019] 本發(fā)明的方法所用的GPIba蛋白可在N端上與同源的人類GPIba信號序列 MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO:2,亦稱"氨基酸殘基16至1"）融合。作為替代方案，所用 的GPIb a蛋白可在N端上與異源信號序列融合，即與一種通常不存在于人類GPIb a多肽 中、但在所選表達系統(tǒng)中會對重組表達的GPIb a蛋白的表達和/或分泌產(chǎn)生有利影響的多 肽融合。例如，MPLQLLLLLILLGPGNSLQLWDTWADEAEKALGPLLARDRR(SEQ