對細(xì)胞的上皮性維持起作用的物質(zhì)的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種以球狀體（spheroid)的形態(tài)的變化為指標(biāo)來篩選對細(xì)胞的上皮 性維持起作用的物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition:EMT)是指細(xì)胞無法維持 作為上皮的特性而獲得作為間質(zhì)系的特性的現(xiàn)象。近年來，報道了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與癌 細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移和/或組織的重塑（remodeling)、纖維化等。因此，人們期待將對細(xì)胞的 上皮性維持起作用的物質(zhì)、即阻礙上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的物質(zhì)、或誘導(dǎo)出作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的 相反現(xiàn)象的間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（Mesenchymal-EpithelialTransition:MET)的物質(zhì)開發(fā)為癌 或纖維癥等的治療藥。
[0003] 以往，作為篩選對細(xì)胞的上皮性維持起作用的物質(zhì)的方法，存在有：使被實驗物質(zhì) 接觸被誘導(dǎo)進行了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以表示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化狀態(tài)的生物標(biāo)記物量的 變化作為指標(biāo)來進行評價的方法（例如參照專利文獻1)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0005] 專利文獻1 :國際公開號W02009/111067

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明要解決的課題
[0007] 但是，以生物標(biāo)記物量為指標(biāo)的篩選方法的檢測耗費工夫和成本。因此，該方法難 以適用于制藥初期階段的篩選那樣的必須快速評價大量樣品的篩選。另外，存在有低濃度 的生物標(biāo)記物的檢測困難因而缺乏可信度這樣的問題。
[0008] 因此，本發(fā)明的目的在于提供一種可迅速且以低成本實施、并且可取得可信度高 的數(shù)據(jù)的對細(xì)胞的上皮性維持起作用的物質(zhì)的篩選方法。
[0009] 用于解決課題的手段
[0010] 本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了，在作為上皮細(xì)胞所表達的細(xì)胞間粘接因子的E-cadherin的 表達量與在規(guī)定的培養(yǎng)基材上培養(yǎng)的細(xì)胞所表現(xiàn)的行為之間存在有相關(guān)關(guān)系。即發(fā)現(xiàn)了， 如果因上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而使得E-cadherin的表達降低而無法維持細(xì)胞的上皮性時，則該細(xì) 胞獲得高的迀移能力而變?yōu)樵谝?guī)定的培養(yǎng)基材上容易形成球狀體的狀態(tài)，并且形成的球狀 體根據(jù)E-cadherin的表達量而呈現(xiàn)不同的形態(tài)。然后，作為以球狀體形態(tài)的變化為指標(biāo)的 篩選方法，完成了本發(fā)明。
[0011] 本發(fā)明的要旨如下所述。
[0012] 本發(fā)明的對細(xì)胞的上皮性維持起作用的物質(zhì)的篩選方法的特征在于，包含如下工 序：(a)在可形成球狀體的培養(yǎng)基材上培養(yǎng)細(xì)胞的工序，（b)使所述細(xì)胞與被實驗物質(zhì)接觸 的工序，（c)以球狀體的形態(tài)的變化作為指標(biāo)來評價被實驗物質(zhì)對于所述細(xì)胞的上皮性維 持所產(chǎn)生的效果的工序。
[0013] 在此情況下，所述工序（c)可通過測定規(guī)定尺寸的球狀體數(shù)量來評價。
[0014] 另外，所述工序（c)可通過使用可檢測球狀體內(nèi)的低氧區(qū)域的試劑來評價。
[0015] 所述工序（a)可在具有作為細(xì)胞粘接面而起作用的規(guī)定的凹凸結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基材 上進行。
[0016] 在此情況下，所述凹凸結(jié)構(gòu)優(yōu)選為通過將包含規(guī)定的平面形狀的單元結(jié)構(gòu)規(guī)則地 進行多個排列而得到的凹凸結(jié)構(gòu)。
[0017] 另外，凹凸結(jié)構(gòu)可以是通過將單元結(jié)構(gòu)間的寬度為3 ym以下、平面方向的形狀為 多邊形并且最小內(nèi)徑為3 ym以下的單元結(jié)構(gòu)規(guī)則地進行多個排列而形成的凹凸結(jié)構(gòu)。
[0018] 發(fā)明效果
[0019] 本發(fā)明的篩選方法由于以球狀體的形態(tài)的變化作為指標(biāo)來進行評價，因而可迅速 且以低成本篩選目標(biāo)物質(zhì)。另外，由于是利用了可認(rèn)為相比于單層細(xì)胞而言更反映了接近 生物體內(nèi)的狀態(tài)的球狀體的方法，因而可有效地進行篩選。進一步，由于可同時地捕捉多個 指標(biāo)來評價，因此可獲得可信度高的篩選結(jié)果。
【附圖說明】
[0020] 圖1是表示本發(fā)明方法中使用的培養(yǎng)基材的凹凸結(jié)構(gòu)的俯視圖。
[0021] 圖2是表示球狀體的形態(tài)的照片。
[0022] 圖3是表示E-cadherin的表達量的照片以及圖表。
[0023]圖4是表示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化阻礙劑對球狀體的形態(tài)所產(chǎn)生的效果的顯微鏡照片。
[0024] 圖5是表示低氧區(qū)域檢測試劑的信號強度的圖表。
[0025] 圖6是表示E-cadherin基因的表達量的圖表。
[0026] 圖7是表示N-cadherin基因的表達量的圖表。
[0027] 圖8是表示Vimentin基因的表達量的圖表。
[0028] 圖9是表示ZEB1基因的表達量的圖表。
[0029] 附圖標(biāo)記說明：
[0030]1單元結(jié)構(gòu)
[0031] 2 線
【具體實施方式】
[0032] 本發(fā)明的篩選方法包含如下工序：（a)在可形成球狀體的培養(yǎng)基材上培養(yǎng)細(xì)胞的 工序，（b)使所述細(xì)胞與被實驗物質(zhì)接觸的工序，（c)以球狀體的形態(tài)的變化作為指標(biāo)來評 價被實驗物質(zhì)對于所述細(xì)胞的上皮性維持所產(chǎn)生的效果的工序。
[0033] 本發(fā)明中的球狀體是指細(xì)胞彼此三維地進行聚集、凝集化而得到的細(xì)胞聚集體。
[0034]另外，本發(fā)明中的細(xì)胞的上皮性維持是指抑制、阻礙了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的狀態(tài)，或 者促進、誘導(dǎo)了間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的狀態(tài)。因此，本發(fā)明的篩選方法大致劃分為阻礙上皮-間 質(zhì)轉(zhuǎn)化的物質(zhì)的篩選方法以及誘導(dǎo)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的物質(zhì)的篩選方法。
[0035] 關(guān)于阻礙上皮_間質(zhì)轉(zhuǎn)化的物質(zhì)的篩選方法，例如可通過如下工序來進行：在可 形成球狀體的培養(yǎng)基材上培養(yǎng)細(xì)胞的工序，使該細(xì)胞與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑接觸的工 序，使培養(yǎng)細(xì)胞與被實驗物質(zhì)接觸的工序，以球狀體的形態(tài)的變化作為指標(biāo)來評價被實驗 物質(zhì)對于細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的效果的工序。作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑，例如可 使用TGF-0、TNF-a、EGF、IL-4等。另外，關(guān)于使培養(yǎng)細(xì)胞與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑接觸 的工序，如果是在使培養(yǎng)細(xì)胞與被實驗物質(zhì)接觸的工序以前，則可在任一時間點進行，例如 可在細(xì)胞接種時進行，也可在細(xì)胞接種后經(jīng)過數(shù)天后進行，也可與使培養(yǎng)細(xì)胞與上皮-間 質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑接觸的工序同時地進行。
[0036] 關(guān)于誘導(dǎo)間質(zhì)_上皮轉(zhuǎn)化的物質(zhì)的篩選方法，例如可通過如下工序來進行：在 可形成球狀體的培養(yǎng)基材上培養(yǎng)細(xì)胞的工序，使培養(yǎng)細(xì)胞與被實驗物質(zhì)接觸的工序，以球 狀體的形態(tài)的變化作為指標(biāo)來評價被實驗物質(zhì)對于細(xì)胞的間質(zhì)_上皮轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的效果 的工序。在該方法中，優(yōu)選使用E-cadherin表達量低的細(xì)胞、例如人胰腺癌衍生細(xì)胞株 MIAPaCa-2、PANC-l、A1165等來進行。此外，也可在通過插入使培養(yǎng)細(xì)胞與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 誘導(dǎo)劑接觸的工序而誘導(dǎo)為間質(zhì)系細(xì)胞之后，使被實驗物質(zhì)與培養(yǎng)細(xì)胞進行接觸。特別是， 使用上皮癌（例如A549)和/或腺癌（例如Capan-2)等的細(xì)胞的情況下，優(yōu)選在接種時進 行利用上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑的處理。
[0037] 本發(fā)明中的以球狀體的形態(tài)變化為指標(biāo)的評價可通過比較負(fù)對照組與被實驗樣 品組的球狀體的外觀及/或內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異來進行。
[0038] 關(guān)于外觀的差異，可將球狀體的形狀（圓形度）、尺寸、數(shù)量等的變化設(shè)為指標(biāo)。例 如，與負(fù)對照組相比，在被實驗樣品組中在球狀體的尺寸變大了的情況下，和/或規(guī)定的尺 寸以上的球狀體數(shù)量增加了的情況下，和/或球狀體的圓形度更接近1的情況下，被實驗物 質(zhì)可評價為是具有維持細(xì)胞的上皮性的效果的物質(zhì)。另外，代替以規(guī)定的尺寸以上的球狀 體數(shù)量的變化為指標(biāo)（或者與其并進），也可將沒有形成球狀體的細(xì)胞數(shù)量的變化設(shè)為指 標(biāo)。這是因為，可將其認(rèn)為是球狀體形態(tài)變化的一個方式。