應(yīng)用于免疫檢測和免疫診斷領(lǐng)域的免疫磁珠的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)中的免疫檢測和免疫診斷領(lǐng)域，具體涉及一種可應(yīng)用于免疫檢測和免疫診斷的免疫磁珠的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫檢測和免疫診斷是利用免疫學(xué)的理論和技術(shù)，通過抗原和抗體的特異性結(jié)合，定性或者定量地測定免疫分子，進(jìn)而分析得到其臨床意義的一種方法。隨著相關(guān)技術(shù)的不斷改進(jìn)，免疫檢測和免疫診斷正朝著更加靈敏、操作更簡單、可實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)聯(lián)合檢測的方向發(fā)展。而不斷進(jìn)步的關(guān)鍵，則是用于免疫分析的納米材料的發(fā)展。
[0003]目前應(yīng)用于免疫分析領(lǐng)域的納米材料有膠體金、量子點(diǎn)、熒光蛋白及磁性納米粒子等。以磁性納米粒子為載體結(jié)合免疫配體形成的免疫磁珠，因具有分離速度快、可重復(fù)性好等特點(diǎn)，近年來逐步得到了越來越多的應(yīng)用。免疫磁珠應(yīng)用于免疫分析領(lǐng)域，主要依靠免疫磁珠分離技術(shù)來實(shí)現(xiàn)免疫檢測和免疫診斷。其中，免疫磁珠上的抗體與待檢測物中的抗原產(chǎn)生特異性結(jié)合，在外加磁場的作用下，免疫磁珠與其結(jié)合的抗原被從待檢測物中分離出來，從而實(shí)現(xiàn)了免疫標(biāo)志物的篩選。在該項(xiàng)技術(shù)中，關(guān)鍵之處在于免疫磁珠的制備，即磁性納米粒子的制備和磁性納米粒子與抗體的結(jié)合。一方面，磁性納米粒子首先需要保證一定的飽和磁化強(qiáng)度，以實(shí)現(xiàn)最終免疫磁珠的磁性分離；另一方面，磁性納米粒子表面應(yīng)攜帶一定量的有機(jī)基團(tuán)，如羧基、氨基、羥基等，方便與抗體的結(jié)合。四氧化三鐵納米粒子由于制備簡單、穩(wěn)定性好、易于修飾等特點(diǎn)，已經(jīng)成為免疫分析領(lǐng)域首選的磁性納米粒子。目前，有多種制備四氧化三鐵納米粒子的方法，其中不乏一些可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；苽涞姆椒?。在這些制備方法當(dāng)中，有機(jī)基團(tuán)一般也同時被引入到納米粒子的表面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種應(yīng)用于免疫檢測和免疫診斷領(lǐng)域的免疫磁珠的制備方法。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):應(yīng)用于免疫檢測和免疫診斷領(lǐng)域的免疫磁珠的制備方法，其特征在于，該方法是利用顆粒粒徑為5?8nm的磁性納米粒子與抗體通過化學(xué)結(jié)合的方式制備免疫磁珠。
[0006]所述的方法具體包括以下步驟:
[0007](I)稱取有機(jī)鐵鹽和無機(jī)鐵鹽，分別溶于去離子水中，以200?500rpm/min的速度攪拌使其充分溶解，然后將兩份溶液混合，繼續(xù)以200?500rpm/min的速度攪拌，使其充分混勻，所述的有機(jī)鐵鹽和無機(jī)鐵鹽的添加量為使Fe2+和Fe 3+的摩爾比1:1?4 ;
[0008](2)稱取抗壞血酸，使其與Fe3+離子的摩爾比為1:3?9，加入步驟(I)得到的混合溶液中，繼續(xù)以200?500rpm/min的速度攪拌；調(diào)節(jié)得到的混合溶液的pH值至9?12，繼續(xù)以200?500rpm/min的速度攬拌5?30min ；
[0009](3)將步驟(2)得到的混合溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，以150?230°C的溫度保溫4 ?15h ；
[0010](4)將步驟(3)得到的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，透析I?2天，隨后冷凍干燥，即可得到目標(biāo)四氧化三鐵磁性納米粒子；
[0011](5)將步驟(4)制得的磁性納米粒子溶于MEST活化緩沖溶液中，加入活化劑，室溫下放置20?60min ;其中磁性納米粒子在MEST活化緩沖溶液中的濃度為I?5mg/300?100 μ L，活化劑的加入量為與磁性納米粒子的質(zhì)量比為2?5:1 ;
[0012](6)以硼砂和硼酸為原料，配置硼酸鹽緩沖溶液，使其pH范圍維持在7?10 ;
[0013](7)將步驟(5)得到的磁性納米粒子及抗體加入步驟(6)配置的硼酸鹽緩沖溶液中，室溫下放置2?5h，使得磁性納米粒子表面的羧基與抗體上的氨基充分反應(yīng)，得到偶聯(lián)抗體的磁性納米粒子，即免疫磁珠；
[0014](8)將步驟(7)得到的免疫磁珠加入溶有一定量的BSA的硼酸鹽緩沖溶液中，室溫下放置20?60min，對免疫磁珠表面沒有參與偶聯(lián)的羧基進(jìn)行封閉；
[0015](9)用硼酸鹽緩沖溶液對步驟⑶得到的免疫磁珠洗滌若干次后，即獲得臨床可應(yīng)用的免疫磁珠。
[0016]所述的有機(jī)鐵鹽包括且不限于檸檬酸鐵、乙酰丙酮鐵、右旋糖酐鐵或葡萄糖酸亞鐵。
[0017]所述的無機(jī)鐵鹽包括且不限于硫酸亞鐵、硫酸鐵、氯化亞鐵或氯化鐵。
[0018]步驟⑵采用0.4?5M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH濃度。
[0019]步驟(5)所述的MEST活化緩沖溶液的濃度為0.005?0.02M，pH范圍在4?6。
[0020]步驟(5)所述的活化劑為碳二亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、丁二酰亞胺、4-二甲氨基吡啶、N，N-二甲基甲酰胺中的一種或幾種。
[0021]步驟(6)所述的硼酸鹽緩沖溶液中硼砂與硼酸的質(zhì)量比為3?6:1。
[0022]步驟(8)溶有一定量的BSA的硼酸鹽緩沖溶液中，BSA的質(zhì)量百分含量為1%?
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn):
[0024]1.通過簡單的操作即可得到小尺寸(5?8nm)、大小均勻的磁性納米粒子。
[0025]2.磁性納米粒子表面攜帶大量羧基基團(tuán)，可較好地實(shí)現(xiàn)與抗體的偶聯(lián)。
[0026]3.偶聯(lián)方法快速、簡單，所用原料成本低，適用于大范圍推廣。
【附圖說明】
[0027]圖1為四氧化三鐵磁性納米粒子的透射電鏡圖片；
[0028]圖2為免疫磁珠的透射電鏡圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0030]實(shí)施例1
[0031]一種可應(yīng)用于免疫檢測和免疫診斷的免疫磁珠的制備方法，具體包括如下步驟:
[0032](I)稱取摩爾比為2:1的檸檬酸鐵和硫酸亞鐵，分別溶于20mL去離子水中，以400rpm/min的速度攪拌使其充分溶解。
[0033](2)將步驟(I)制得的兩份溶液混合，繼續(xù)以400rpm/min的速度攪拌，使其充分混勻。
[0034](3)稱取0.1g抗壞血酸，加入步驟(2)得到的混合溶液中，使其與Fe3+離子的摩爾比為1:6，繼續(xù)以400rpm/min的速度攪拌。
[0035](4)向步驟(3)得到的混合溶液中滴加濃度為0.4M的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)該混合溶液的pH值至10，繼續(xù)以400rpm/min的速度攪拌lOmin。
[0036](5)將步驟(4)得到的混合溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，以200°C的溫度保溫10h。
[0037](6)將步驟(5)得到的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，透析2天，隨后冷凍干燥，即可得到目標(biāo)四氧化三鐵磁性納米粒子。
[0038](7)將Img步驟(6)制得的磁性納米粒子溶于300 μ L的MEST活化緩沖溶液中，按照與磁性納米粒子的質(zhì)量比為3:1加入活化劑，活化劑由質(zhì)量比為2:1的碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺組成，室溫下放置20min。
[0039](8)取摩爾比為3:1的硼砂和硼酸配置硼酸鹽緩沖溶液，調(diào)節(jié)其pH至9。
[0040](9)加入步驟(7)得到的磁性納米粒子及0.15mg抗β _hCG抗體，室溫下放置3h得到偶聯(lián)抗體的磁性納米粒子，即免疫磁珠。
[0041](10)將步驟(9)得到的免疫磁珠加入溶有1%的BSA的硼酸鹽緩沖溶液中，室溫下放置20min。
[0042](11)用硼酸鹽緩沖溶液對步驟(10)得到的免疫磁珠洗滌4次后，即獲得臨床可應(yīng)用的免疫磁珠。
[0043]所得四氧化三鐵磁性納米粒子的透射電鏡圖如圖1所示，偶聯(lián)抗體的免疫磁珠的透射電鏡圖如圖2所示。可以看出制得的磁性納米粒子平均尺寸為5?8nm，且粒徑分布均勻。偶聯(lián)后的磁性納米粒子周邊出現(xiàn)襯度較低的絮狀物，應(yīng)為大分子的抗體。
[0044]實(shí)施例2
[0045]一種可應(yīng)用于免疫檢測和免疫診斷的免疫磁珠的制備方法，具體包括如下步驟:
[0046](I)稱取一定比例的乙酰丙酮鐵和氯化亞鐵，分別溶于1mL去離子水中，以200rpm/min的速度攪拌使其充分溶解；
[0047](2)將步驟⑴制得的兩份溶液混合，使Fe2+和Fe3+的摩爾比1:1，繼續(xù)以200rpm/min的速度攪拌，使其充分混勻；
[0048](3)稱取一定量的抗壞血酸，使其與Fe3+離子的摩爾比為1:3，加入步驟⑵得到的混合溶液中，繼續(xù)以200rpm/min的速度攪拌；
[0049](4)采用0.4M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)步驟(3)得到的混合溶液的pH值至9，繼續(xù)以200rpm/min的速度攪拌5min ；
[0050](5)將步驟(4)得到的混合溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，以150°C的溫度保溫4h ;
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