一種裂殖壺菌藻粉中dha含量的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是一種裂殖壺菌藻粉中DHA含量的測(cè)定方法，具體涉及裂殖壺菌中不飽和 脂肪酸DHA的定量測(cè)定，屬于不飽和脂肪酸的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酸是細(xì)胞的重要組成部分，不僅為細(xì)胞活動(dòng)提供能量，含有3~5個(gè)雙建的多 不飽和脂肪酸還是前列腺素和白細(xì)胞三烯的合成前體，據(jù)研宄表明，α -亞麻酸、二十碳五 烯酸（ΕΡΑ)、二十二碳六烯酸（DHA)等η-3多不飽和脂肪酸還具有抗發(fā)炎、抗血栓、抗心律失 常、降血脂和軟化血管等作用。η-3多不飽和脂肪酸的主要來(lái)源有植物油，例如：例如：菠 菜、馬齒莧、亞麻的種子、亞麻仁以及胡桃等，其中以亞麻籽油中含α-亞麻酸（高達(dá)57%) 最多，其次是菜籽油、大豆油和小麥胚芽油（7%~13%);其他來(lái)源包括一些堅(jiān)果、種子、 蔬菜和水果、蛋黃、禽肉，其中，魚(yú)類是主要的EPA和DHA來(lái)源；除此之外，海洋微生物以及 一些藻類植物也是多不飽和脂肪酸的良好來(lái)源，裂殖壺菌即是其中一種。
[0003] 裂殖壺菌（Schizochytrium)作為一類藻類的海洋真菌，該菌易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快，已實(shí) 現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，其細(xì)胞內(nèi)積累了大量的油脂，90%以上油脂以人體易吸收的甘油三脂（TG) 形式存在，不飽和脂肪酸含量很高，主要為DHA，其它多不飽和脂肪酸含量很低。毒性3+試 驗(yàn)證明使用裂殖壺菌作為食品添加劑飼喂大鼠、兔和豬是安全可靠的，其安全性已得到美 國(guó)FDA的認(rèn)可。目前，壺菌藻粉作為一種理想的DHA新生資源，已廣泛應(yīng)用于食品、藥品 和保健品。國(guó)內(nèi)外公開(kāi)報(bào)道裂殖壺菌藻粉文獻(xiàn)較多，大多集中在裂殖壺菌的工業(yè)化生產(chǎn)、油 脂提取、營(yíng)養(yǎng)成分分析等，如《裂殖壺菌DHA提取方法的優(yōu)化和工業(yè)化應(yīng)用》（南京科技大 學(xué)，碩士論文，dingweicui，2012. 05)記載的對(duì)微生物油脂的提取方法，和《富含DHA的裂殖 壺菌的工業(yè)化生產(chǎn)試驗(yàn)、脂肪酸提取及應(yīng)用研宄》（中國(guó)海洋大學(xué)，博士學(xué)位論文，宋曉金， 2008. 06. 01)記載的工業(yè)化生產(chǎn)及脂肪酸的提取技術(shù)，但關(guān)于裂殖壺菌藻粉中DHA的定量 測(cè)定，尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種裂殖壺菌藻粉中DHA含量的測(cè)定方法，該測(cè)定方法是 對(duì)裂殖壺菌藻粉中提取的油脂進(jìn)行的氣相色譜檢測(cè)，使用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定油脂中 的脂肪酸含量，具有樣品處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、快速的特性，測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好、可行度高， 并為裂殖壺菌藻粉DHA的質(zhì)量控制提供了檢測(cè)方法依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種裂殖壺菌藻粉中DHA含量的測(cè)定方法，所述 的測(cè)定方法包括以下步驟： A :備樣，取標(biāo)準(zhǔn)溶液和裂殖壺菌藻粉樣品，在裂殖壺菌藻粉樣品中加入內(nèi)標(biāo)物和鹽酸， 混合后提取油脂，所述的內(nèi)標(biāo)物為十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液，所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液選用Supelco 37種 脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度為10 mg/mL ; B :制備供試品溶液，將步驟A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在 脂肪酸甲酯溶液中加入異辛烷和飽和NaCl溶液，經(jīng)混合、靜置分層后，移取上層清液，脫水 后制得供試品溶液，備用； C :測(cè)定，分別移取等量的供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液I y L，注入氣相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定， 測(cè)定條件包括： 色譜柱：石英毛細(xì)管柱， 柱溫：60~240°C， 檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度：250~270°C， 汽化室溫度：240~260 °C ; 氣體流量：載氣為高純氮，流速〇. 8~I. 2mL/min，空氣流速300~400mL/min，氫氣流 速 30 ~40mT,/min , 分流比：（5~20) :1。
[0006] 本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，適合于批量裂殖壺菌藻粉樣品脂肪酸的定 量測(cè)定。裂殖壺菌藻粉樣品中的油脂提取后，經(jīng)皂化、甲酯化后衍生為相應(yīng)的脂肪酸甲酯， 制備成供試品溶液后，以石英毛細(xì)管柱分離，氫火焰離子化檢測(cè)器測(cè)定，以樣品峰的保留時(shí) 間與脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各脂肪酸的含量，測(cè)定結(jié)果表明，在 本發(fā)明涉及的色譜條件下，37種脂肪酸甲酯在65 min內(nèi)均獲得較好的分離。
[0007] 在本發(fā)明中，內(nèi)標(biāo)物選用濃度為10. 0 mg/mL的十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液，具有測(cè)定結(jié)果 重現(xiàn)性好、可信度高等良好的使用效果，當(dāng)然，為提高內(nèi)標(biāo)物的使用效果，在所述的步驟A 中，所述鹽酸的濃度為4 mol/L，所述裂殖壺菌藻粉樣品、內(nèi)標(biāo)物、鹽酸的質(zhì)量比為（0. 2~ 0.8) :(4 ~6) :(4 ~6)〇
[0008] 在所述的步驟A中，油脂的提取包括： A. 1 :將裂殖壺菌藻粉樣品、內(nèi)標(biāo)物、鹽酸的混合物依次進(jìn)行恒溫振蕩、沸水浴加熱和速 冷降溫后，制得樣品溶液，鹽酸濃度為4mol/mL，通常使用漩渦混勻Imin后，再送至水槽進(jìn) 行恒溫振蕩； A. 2 :在步驟A. 1制得的樣品溶液中加入體積比為1:1的二氯甲燒一甲醇混合溶劑，混 合均勻后進(jìn)行離心操作，取氯仿層備用； A. 2 :在步驟A. 2制得的氯仿層加入等體積的0. 1%氯化鈉溶液，混合均勻后進(jìn)行離心操 作，取氯仿層，移至干燥瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸發(fā)后得到油脂。
[0009] 在所述的步驟A. 1中，恒溫振蕩時(shí)，溫度控制在50~70°C，振蕩30~50min，振蕩 頻率80~120次/min ;沸水浴的加熱時(shí)間為4~6min ;使用-10~-30°C的溫度進(jìn)行速冷 降溫。
[0010] 所述離心操作的時(shí)間控制在8~12次/min，轉(zhuǎn)速控制在4000~6000r/min。
[0011] 在所述的步驟B中，脂肪酸甲酯溶液的制備包括： B. 1 :皂化，在步驟A提取的油脂中加入0. 5 mol/L的氫氧化鉀一甲醇，充N2，水浴加熱 并回流； B. 2 :甲酯化：回流8~12min后，加入13~15%的三氟化硼-甲醇，水浴加熱并回流 15~30min后，制得脂肪酸甲酯溶液。
[0012] 皂化反應(yīng)方式式如下：
甲酯化反應(yīng)方程式如下：
制得的脂肪酸甲酯溶液為二十二碳六烯酸甲酯，其結(jié)構(gòu)式為：
在所述的步驟B中，異辛烷加入沸騰的脂肪酸甲酯溶液中，停止加熱后，再加入飽和 NaCl溶液，脂肪酸甲酯溶液、異辛烷、飽和NaCl溶液的質(zhì)量比為（40~60) : (40~60): (15~30)，加入異辛烷的目的是：異辛烷作為弱極性溶劑，經(jīng)過(guò)渦旋混合，待測(cè)的二十二碳 六烯酸甲酯（DHA)全部從KOH-三氟化硼-甲醇混合溶液中轉(zhuǎn)移到異辛烷中；加入飽和NaCl 溶液目的是：為了使異辛烷溶液與KOH-三氟化硼-甲醇-水混合溶液完全分層，在實(shí)現(xiàn)上 述過(guò)程時(shí)，脂肪酸甲酯溶液、異辛烷、飽和NaCl溶液的使用量應(yīng)按照上述質(zhì)量比范圍嚴(yán)格 操作，才能保證操作過(guò)程的順利進(jìn)行。
[0013] 在所述的步驟C中，氣相色譜儀的測(cè)定條件中，色譜柱的初始溫度為60 °C，以4 °C/ min升至160 °C后，再以2 °C/ min升至240 °C，其目的是：通過(guò)程序升溫，保證裂殖 壺菌藻粉脂肪酸分離度完全滿足定量測(cè)定需要。
[0014] 進(jìn)一步的，所述氣相色譜儀的測(cè)定條件中： 色譜柱為 Supelco SP?-2560 石英毛細(xì)管柱，100 mXO. 25 mm i.d. X0. 20 μπι; 檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為260°C ; 汽化室溫度：250 °C ; 氣體流量：載氣為高純氮，流速1.0 mL/min，空氣流速350mL/min，氫氣流速35mL/min ; 柱流速：1. O mL/min ; 尾吹流速：40 mL/min ; 分流比：1〇 :1。
[0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果： (1)本發(fā)明是以十三烷酸為內(nèi)標(biāo)物，采用氣相色譜定量測(cè)定裂殖壺菌藻粉中的脂肪酸 (DHA)的檢測(cè)方法，測(cè)定結(jié)果以樣品峰的保留時(shí)間與脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，并 按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各脂肪酸的含量，具有樣品處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、快速的特性，測(cè)定結(jié)果重現(xiàn) 性好、可行度高，并為裂殖壺菌藻粉DHA的質(zhì)量控制提供了檢測(cè)方法依據(jù)。
[0016] (2)本發(fā)明選擇十三烷酸作為內(nèi)標(biāo)物，十三烷酸（CH3(CH2)11C02H，分子量214. 34 )是一種直鏈脂肪酸，其結(jié)構(gòu)與裂殖壺菌藻粉中C16:0、C22:6 (DHA)相似，且在所選定的 色譜條件下，十三烷酸與C16:0、C22:6得到完全分離，且商品化的十三烷酸純度可達(dá)98% 以上；另一方面，在裂殖壺菌藻粉油脂提取過(guò)程就加入十三烷酸作為內(nèi)標(biāo)，可保證內(nèi)標(biāo)物與 DHA完成同樣的前處理過(guò)程，即酸熱法提取-皂化-甲酯化，從而保證DHA測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確 性。
[0017] (3)本發(fā)明使用酸熱法對(duì)裂殖壺菌藻粉中的油脂進(jìn)行提取，利用鹽酸的加入，保證 了裂殖壺菌藻粉樣品溶液在水浴中振蕩后，使原來(lái)結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞壁變得疏松，再經(jīng)沸水 浴及速凍降溫處理后，使細(xì)胞壁進(jìn)一步的被破壞，有利于細(xì)胞壁中糖、蛋白質(zhì)、油脂等成分 的析出，再用極性較強(qiáng)的三氯甲烷-甲醇混合溶劑進(jìn)一步有效地浸提出裂殖壺菌藻粉細(xì)胞 中的油脂，操作簡(jiǎn)單、快速。