檢測(cè)孔雀石綠的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)品檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)孔雀石綠的膠體金免疫層 析試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 孔雀石綠作為染色劑，用于皮革業(yè)、紡織業(yè)、制陶業(yè)、食品和生物的染色，是人工合 成的三苯甲烷類(lèi)化學(xué)物。同時(shí)，孔雀石綠也可以用作殺菌劑，驅(qū)蟲(chóng)劑，用于預(yù)防與治療水生 動(dòng)物細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)的感染，由于其成本低，效果顯著，所以被普遍用在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。 然而隨著研宄的深入，孔雀石綠的高毒性，高殘留的性質(zhì)及潛在的致畸、致癌、致突變等毒 副作用倍受大家的關(guān)注。
[0003] 繼"蘇丹紅1號(hào)"后，2005年英國(guó)發(fā)現(xiàn)的鮭魚(yú)體內(nèi)的"孔雀石綠"事件又一次掀起 了大的食品安全風(fēng)暴。同年六月，在對(duì)我國(guó)湖北、河南等地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)， 孔雀石綠被用來(lái)預(yù)防和治療魚(yú)的水霉病、小瓜蟲(chóng)病等和延長(zhǎng)在運(yùn)輸過(guò)程中魚(yú)鱗受損的魚(yú)的 生命，該發(fā)現(xiàn)引起了國(guó)家的重視和民眾的恐慌?？兹甘G在2002年被作為禁用獸藥列入 禁止在食品動(dòng)物中使用的獸藥名單上，因此我國(guó)要求孔雀石綠不得在食品中檢出。近些年 來(lái)，水產(chǎn)品安全問(wèn)題越來(lái)越受到重視，如我國(guó)制定了一系列法律法規(guī)，加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)品監(jiān)督管 理，完善可追溯體系，普及水產(chǎn)品養(yǎng)殖技術(shù)等相應(yīng)措施，但是違法添加禁用漁藥的事件仍是 頻頻曝光。2005年香港在一批來(lái)自?xún)?nèi)地的一些豆豉鯪魚(yú)罐頭中查出含有孔雀石綠，大大降 低了這些罐頭的銷(xiāo)售額；2006年由于加工鰻魚(yú)中查出孔雀石綠，導(dǎo)致第一天然食品利潤(rùn)下 跌。英國(guó)、美國(guó)、日本等一些國(guó)家已經(jīng)將孔雀石綠列為食品中不得檢出的藥物，歐盟也對(duì)孔 雀石綠的殘留量做出明確規(guī)定，檢出限為2 μ g/kg?？兹甘G的屢禁不止不僅使消費(fèi)者人心 惶惶，還使我國(guó)經(jīng)濟(jì)遭受損失，在多個(gè)批次出口的水產(chǎn)品中查出藥殘超標(biāo)，讓我國(guó)水產(chǎn)品出 口受到限制和環(huán)境壁皇。嚴(yán)重影響我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)名譽(yù)和健康發(fā)展。
[0004] 水產(chǎn)品的安全問(wèn)題受到了政府和人民的廣泛關(guān)注，尤其是孔雀石綠的屢禁不止， 讓大家對(duì)水產(chǎn)品安全更為憂(yōu)心忡忡。因此，我們不僅要增強(qiáng)對(duì)孔雀石綠的監(jiān)督管理，還要加 強(qiáng)檢測(cè)力度。目前檢測(cè)藥殘的方法主要是應(yīng)用儀器進(jìn)行檢定，但是這些方法操作復(fù)雜，所需 時(shí)間長(zhǎng)，成本高，不適于大批量檢測(cè)，所以要建立一種快速檢測(cè)方法，能夠快速，簡(jiǎn)單的實(shí)現(xiàn) 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，保證食品來(lái)源是健康、安全的，從而有效的實(shí)現(xiàn)食品安全生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)。
[0005] 目前，常用于檢測(cè)孔雀石綠殘留量的方法主要包括：理化分析法、微生物學(xué)檢測(cè)法 和免疫分析檢測(cè)法。常見(jiàn)的理化分析檢測(cè)法有高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、薄層 色譜法、毛細(xì)管電泳法等，這些檢測(cè)方法靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果可靠，常作為確證方法檢測(cè)藥 物殘留，但設(shè)備昂貴，樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，對(duì)操作人員要求高，耗時(shí)較長(zhǎng)，不適合批量樣品 的快速檢測(cè)。微生物學(xué)檢測(cè)法不需要專(zhuān)業(yè)昂貴的儀器，但操作耗時(shí)長(zhǎng)，特異性、敏感性差，容 易受其他藥物的干擾，在定量上尚不成熟，檢測(cè)結(jié)果有時(shí)不能滿(mǎn)足國(guó)家最高殘留限量的要 求，不能滿(mǎn)足現(xiàn)代檢測(cè)的需要。隨著免疫學(xué)和免疫技術(shù)的飛速發(fā)展，免疫分析法迅速發(fā)展起 來(lái)，成為檢測(cè)藥物殘留的一種新型方法。免疫分析法主要是利用抗原、抗體的特異性結(jié)合來(lái) 檢測(cè)藥物、蛋白質(zhì)、激素、微生物等各種物質(zhì)，主要分為：放射性免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、免 疫傳感器法、膠體金免疫層析技術(shù)等。膠體金免疫層析技術(shù)是一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，是 在免疫層析的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，以膠體金為示蹤物與抗原、抗體特異性反應(yīng)相結(jié)合的一 種檢測(cè)技術(shù)。該檢測(cè)方法結(jié)果判讀簡(jiǎn)單，不需要專(zhuān)業(yè)的操作人員，檢測(cè)時(shí)間短，攜帶方便，特 別適合大批量樣品的藥物殘留的快速篩查。
[0006] 在現(xiàn)有技術(shù)中，利用膠體金免疫法檢測(cè)孔雀石綠藥物殘留的研宄也有不少，趙春 城等研制出用于檢測(cè)無(wú)色孔雀石綠的膠體金免疫層析試紙條，檢出限在20 μ g/L;山珊等 將試紙條上T線(xiàn)和C線(xiàn)的吸光度通過(guò)膠體金讀取儀進(jìn)行讀取，建立了用膠體金試紙條定量 檢測(cè)孔雀石綠的方法。歐美等國(guó)于20世紀(jì)70、80年代，就已經(jīng)開(kāi)始關(guān)注在動(dòng)物體內(nèi)抗生 素的殘留問(wèn)題，制定了獸藥的最高殘留量（MRL)、休藥期（WDT)及相關(guān)的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)。歐盟 (EU)規(guī)定了，孔雀石綠最高殘留限量（MRL)為2 yg/kg。因此，現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)孔雀石綠的 膠體金免疫檢測(cè)試紙尚不能滿(mǎn)足歐美等西方國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于產(chǎn)品出口來(lái)說(shuō)，對(duì)于我國(guó)的 水產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)了很大的困難。
[0007] 有鑒于此，本發(fā)明人研宄和設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)孔雀石綠的膠體金免疫層析試紙條及 其制備方法，本案由此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確并適合現(xiàn)場(chǎng)使用 的專(zhuān)門(mén)用于檢測(cè)檢測(cè)孔雀石綠的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，以便對(duì)孔雀石綠藥 物進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)，符合歐盟及WTO的最低檢出限的規(guī)定。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是：
[0010] 一種檢測(cè)孔雀石綠的膠體金免疫層析試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包 被膜、吸水墊及PVC底板，所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述硝酸纖維素包被膜及所述吸水墊 依次搭接在所述PVC底板上，所述結(jié)合墊包被設(shè)有孔雀石綠單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；所 述硝酸纖維素包被膜上設(shè)有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，所述檢測(cè)線(xiàn)包被有孔雀石綠抗原，所述質(zhì)控 線(xiàn)包被有羊抗鼠 IgG。
[0011] 一種檢測(cè)孔雀石綠的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0012] 步驟一、膠體金的制備：取1個(gè)250mL燒杯，加入IOOmL 0. 01 %氯金酸溶液，于恒 溫磁力攪拌器上使用溫度檔400°C對(duì)其進(jìn)行加熱，轉(zhuǎn)速為300r/min，加熱至沸騰狀態(tài)后，沸 騰時(shí)的實(shí)際溫度為l〇〇°C，向燒杯中快速加入2mL 1 %檸檬酸三鈉溶液，燒杯中的溶液變?yōu)?紅色后再加熱lOmin，直至溶液透亮，冷卻至室溫，4°C密封保存，即制得膠體金；
[0013] 步驟二、金標(biāo)抗體的制備及純化：取調(diào)好pH為9. 0的所述膠體金ImL于2. OmL離 心管中，向離心管中加入15 μ g/ml的孔雀石綠單克隆抗體，用渦旋儀渦旋IOmin后靜置 15min ;向離心管中加入30 yL 10% BSA溶液，用渦旋儀渦旋lOmin，靜置lOmin，制得金標(biāo) 抗體，即孔雀石綠單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；
[0014] 同時(shí)，將制得的金標(biāo)抗體溶液于4°C 2500r/min，離心10min，去除下層沉淀，將上 清液轉(zhuǎn)到另一離心管中，于4°C 9000r/min，離心30min，去除上清液，將沉淀用膠體金稀釋 溶液稀釋至原體積的1/20,于4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0015] 步驟三、試紙條的組裝：（1)將硝酸纖維素包被膜，即NC膜，和吸水墊分別貼于PVC 底板上，吸水墊壓住NC膜上方l-2mm ; (2)將粘貼好NC膜和吸水墊的PVC底板在切條機(jī)上 切割成4_寬的試紙條；(3)將樣品墊和結(jié)合墊切成4_寬的條，同時(shí)將結(jié)合墊浸泡金標(biāo)抗 體溶液中，并于37°C烘干，制得金標(biāo)墊；(4)烘干后的金標(biāo)墊剪成Icm長(zhǎng)的小塊并貼于PVC 底板上，金標(biāo)墊壓住NC膜下方l-2mm，同時(shí)用樣品墊壓住金標(biāo)墊下方l-2mm，根據(jù)試紙條長(zhǎng) 度修剪樣品墊；（5)在結(jié)合墊和吸收墊之間的NC膜上依次包被孔雀石綠抗原和羊抗鼠 IgG， 分別作為檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)，采用BioDot劃膜儀進(jìn)行包被劃線(xiàn)，具體參數(shù)為平臺(tái)移動(dòng)速度 4〇1111]1/8，單位噴量：檢測(cè)線(xiàn)為0.8以17〇]1，質(zhì)控線(xiàn)為1.0以17〇]1，使得孔雀