一種眼角膜相關(guān)疾病的致病機(jī)理分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種利用特定儀器對(duì)于眼角膜相關(guān)疾病致病機(jī)理在納米尺度上識(shí)別與分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，眼角膜是人類(lèi)必不可少的功能組織，它是位于眼球前端的一層透明薄摸，由上皮細(xì)胞層，前彈力層，基質(zhì)層，后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成；其在眼球的屈光和眼球的保護(hù)中起到重要的作用；正由于眼角膜的特殊結(jié)構(gòu)和重要作用，眼角膜相關(guān)疾病對(duì)于人類(lèi)的正常生產(chǎn)生活會(huì)產(chǎn)生巨大的影響，目前全世界投入了巨大的資源對(duì)于不同眼角膜疾病進(jìn)行相關(guān)研宄，雖然取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但是對(duì)于許多眼角膜疾病微觀層面致病機(jī)理仍知之甚少，比如常見(jiàn)的福克斯內(nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良，致使眼角膜移植仍是主要的根治辦法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]基于上述的研宄可知，開(kāi)發(fā)微觀尺度的眼角膜相關(guān)疾病的分析方法以尋找膠原蛋白纖維結(jié)構(gòu)上的致病機(jī)理的重要性，本發(fā)明發(fā)展了一種利用定量納米力學(xué)原子力顯微鏡在納米尺度上從形貌和相關(guān)力學(xué)性質(zhì)兩方面提出于眼角膜相關(guān)疾病致病原因的輔助分析方法，并以福克斯內(nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良疾病作為例子進(jìn)行詳細(xì)的闡述，以證明該方法在眼角膜相關(guān)疾病研宄中的普適性。
[0004]本發(fā)明的目的在于，提供一種在納米尺度上利用定量納米力學(xué)原子力顯微鏡通過(guò)形貌和相關(guān)力學(xué)性質(zhì)對(duì)眼角膜相關(guān)疾病致病機(jī)理的輔助研宄方法，按照下述步驟進(jìn)行:
(I)利用全飛秒激光微創(chuàng)手術(shù)獲取相關(guān)病變眼角膜樣本，并以健康眼角膜樣本作為健康對(duì)照。
[0005](2)將眼角膜樣本平整鋪與干凈云母表面，氮?dú)夥諊稍铩?br>[0006](3)利用定量納米力學(xué)原子力顯微鏡在大氣下峰值力輕敲模式下對(duì)干燥過(guò)后的病變眼角膜樣本和對(duì)照樣本進(jìn)行表征，獲得納米分辨率的眼角膜膠原蛋白纖維形貌圖和相對(duì)應(yīng)的定量楊氏模量圖。
[0007]比較形貌圖中的不同特征形貌指紋和楊氏模量分布，確定病變樣本中的疑似膠原蛋白纖維病變特征形貌，從而在納米尺度上推斷出眼角膜疾病病癥及形成原因。
[0008]進(jìn)一步地，在進(jìn)行定量納米力學(xué)原子力顯微鏡表征的前后，利用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡對(duì)病變和對(duì)照樣本切片進(jìn)行輔助表征，以輔助辨別疑似病變膠原蛋白纖維的形貌特質(zhì)。
[0009]進(jìn)一步地，將生理鹽水滴加在病變樣本上，使該樣本完全進(jìn)入在生理鹽水中，使得眼角膜處于近生理狀態(tài)；在液相峰值力輕敲模式下原位重復(fù)定量納米力學(xué)原子力顯微鏡表征，并將浸入生理鹽水前后的形貌圖和相對(duì)應(yīng)的楊氏模量圖進(jìn)行對(duì)照，推斷出病變眼角膜在納米尺度上的致病原因。
[0010]步驟1-3是在大氣中進(jìn)行，所以眼角膜處于失水狀態(tài)，這里是對(duì)找到的病變組織在近生理?xiàng)l件下(生理鹽水中)進(jìn)一步的確認(rèn)，并對(duì)其在生理?xiàng)l件下的特點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)。
[0011]浸入生理鹽水前的樣品(即為大氣下測(cè)量樣品)，先利用大氣下峰值力輕敲模式進(jìn)行納米力學(xué)燕子力顯微鏡表征，然后同一眼角膜浸入生理鹽水后再利用液相峰值力輕敲模式重新表征一次；由于表征時(shí)原子力顯微鏡的掃描探針也浸入在生理鹽水中，所以使用的是液相峰值力輕敲模式；由于利用了眼角膜表面的特征形貌進(jìn)行了標(biāo)記，所以前后兩次掃描的是眼角膜上的同一位置；為眼角膜上在浸入生理鹽水前(大氣中)和浸入生理鹽水后的同一位置。
[0012]所述步驟(2)中氮?dú)飧稍锏臅r(shí)間為24h。
[0013]所述干凈云母表面是采用透明膠帶新剝離過(guò)得到的云母表面；新剝離過(guò)得云母具有原子級(jí)別的平整度，使得云母基底不會(huì)在接下來(lái)的對(duì)眼角膜的原子顯微鏡測(cè)量引入假象；更重要的是新剝離過(guò)得云母表面呈超親水狀態(tài)而表面吸附有微量的水，此水層有助于使卷曲的Imm后的眼角膜平鋪在云母基底上，極大有助于其后原子力顯微鏡的表征。
[0014]綜上所述，本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種全新的在納米尺度上理解眼角膜相關(guān)疾病機(jī)理的輔助方法。
[0015]本發(fā)明至少具有以下有益效果:
本發(fā)明在納米尺度上通過(guò)定量納米力學(xué)原子力顯微鏡對(duì)比眼角膜主要主城成分的膠原蛋白纖維形貌和力學(xué)性能的變化來(lái)使人們從膠原蛋白纖維納米形貌和力學(xué)性質(zhì)的變化的角度，理解一系列眼角膜相關(guān)疾病的結(jié)構(gòu)致病機(jī)理。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是福克斯內(nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良癥中后彈力層增厚及產(chǎn)生水泡的宏觀病癥示意圖和光學(xué)顯微鏡證據(jù)；其中插圖則顯示了利用全飛秒激光微創(chuàng)手術(shù)獲得病變眼角膜樣本的過(guò)程片段。
[0017]圖2是健康眼角膜后彈力層和?？怂箖?nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良癥中病變后彈力層在大氣環(huán)境中形貌和楊氏模量的對(duì)比圖；其中圖A、B、C、D分別是就正常眼角膜后彈力層在投射電鏡下的切片照片和定量納米力學(xué)原子力顯微鏡的低分辨率、高分辨率和楊氏模量分布圖；圖E、F、G、H則是對(duì)應(yīng)的?？怂箖?nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良癥中病變后彈力層在投射電鏡下的切片照片和定量納米力學(xué)原子力顯微鏡的低分辨率、高分辨率和楊氏模量分布圖；圖中白色箭頭標(biāo)注出對(duì)比正常后彈力層，病變后彈力層所展現(xiàn)出來(lái)的特征變異結(jié)構(gòu)。
[0018]圖3是?？怂箖?nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良癥中病變后彈力層在浸入生理鹽水前后形貌和楊氏模量圖的比較；圖A和B分別為病變后彈力層同一位置加入生理鹽水前后的形貌圖，圖C和D是從圖B中不同放大倍數(shù)形貌圖，圖E為圖D相對(duì)應(yīng)的楊氏模量圖，圖F是圖E的楊氏模量分布；灰色箭頭之處判定原位掃描的參照物，白色箭頭表明病變后彈力層所展現(xiàn)出來(lái)的特征變異結(jié)構(gòu)完全吸水前后的位置，可見(jiàn)，浸入生理鹽水后，特征變異結(jié)構(gòu)的周期結(jié)構(gòu)消失，轉(zhuǎn)變?yōu)橥黄穑卣髯儺惤Y(jié)構(gòu)相對(duì)于正常眼角膜纖維蛋白的楊氏模量減小，圖E中的黑色結(jié)構(gòu)，圖F中左下角的曲線分布。
[0019]【具體實(shí)施方式】下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0020]I舉例病癥介紹
?？怂箖?nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良是一種比較常見(jiàn)的主要影響老年人的眼角膜疾??；主要病癥表現(xiàn)為由于內(nèi)皮細(xì)胞層的細(xì)胞大量死亡，導(dǎo)致后彈力層影響不良，最終增厚，渾濁，并形成刺痛水泡。最終視力下降甚至失明；雖然人們對(duì)該疾病在生理層面的致病原因已經(jīng)達(dá)成共識(shí)，但是由于目前眼角膜相關(guān)疾病的診斷分析主要依賴于光學(xué)儀器，受光源能量和波長(zhǎng)的局限，對(duì)于后彈力層增厚及產(chǎn)生水泡的微觀層面原因仍所知甚少；眾所周知眼角膜的主要組成成分是水分子和膠原蛋白纖維，由于膠原蛋白纖維的直徑往往處于幾十納米到幾百納