一種用于抗生素殘留檢測的微陣列適配體傳感器制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及所述的一種用于抗生素殘留檢測的微陣列適配體傳感器制備方法，屬于生物傳感器制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，奶產(chǎn)量大幅度提高，新鮮牛奶和奶制品已經(jīng)成為人民(尤其是老人和兒童)生活食品中的重要組成部分?？股乇粡V泛用于預(yù)防及治療奶牛疾病，由于頻繁、超劑量使用，使得牛奶等動(dòng)物源食品中存在一定量的抗生素殘留。長期飲用或食用有抗生素殘留的牛乳或乳制品，也就相當(dāng)于長期低劑量的攝入抗生素，從而使人體腸道內(nèi)的正常菌群受到抑制，導(dǎo)致致病菌大量繁殖引起全身或局部感染。由于奶牛乳腺炎發(fā)病率較高，用四環(huán)素來治療乳腺炎等產(chǎn)科疾病仍較普遍，這容易導(dǎo)致在牛奶中四環(huán)素的殘留。過量使用四環(huán)素類抗生素不可避免會(huì)使母體代謝產(chǎn)物等相關(guān)抗生素殘留于動(dòng)物的肌肉、蛋、奶、臟器組織中，進(jìn)而通過食物鏈影響人體健康。牛奶中含有抗生素殘留，不僅對人的健康造成很大的危害，而且對乳品加工企業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。因此必須嚴(yán)格控制牛奶中抗生素殘留，除了要做好科學(xué)飼養(yǎng)、精心管理、正確擠奶和預(yù)防疾病外，還要規(guī)范抗生素的使用。因此要避免上述情況的發(fā)生，除了從源頭上控制抗生素的使用外，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測出動(dòng)物源食品中的抗生素殘留是保障畜產(chǎn)品安全的有效途徑。可見，加強(qiáng)對牛奶等農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留的檢測，尤其是保障人類健康有著十分深遠(yuǎn)的意義。
[0003]傳統(tǒng)的抗生素殘留檢測方法主要有:氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/LC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)、熒光分析、酶聯(lián)免疫法(ELISA)。這些方法雖然選擇性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢出限低，可同時(shí)檢測多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設(shè)備，樣品前處理過程繁瑣、費(fèi)時(shí)，并且對分析人員的技術(shù)水平要求很高，不適于現(xiàn)場快速檢測。核酸適配體(Aptamer)是人工合成的核酸序列，經(jīng)多次篩選獲得的核酸適配體與靶分子有很高的特異性和親和力。而且適配體是由體外篩選和擴(kuò)增獲得的，不需要免疫動(dòng)物或培養(yǎng)細(xì)胞，具有極好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，很高的純度，可以避免產(chǎn)生批間差異。另外，核酸適配體無免疫原性，可在不同溫度、不同離子濃度、金屬螯合劑存在條件下反復(fù)變性和復(fù)性，在合成過程中，各種報(bào)告分子(熒光素或生物素)和功能集團(tuán)可精確地結(jié)合在適配體位點(diǎn)上。目前用抗體進(jìn)行檢測和診斷的技術(shù)幾乎可以全部由適配體來代替。抗生素是小分子半抗原物質(zhì)，難以制備相應(yīng)的抗體，即使制備出相應(yīng)的抗體，也存在免疫傳感器的信號(hào)弱、重復(fù)使用性差、重現(xiàn)性不能滿足實(shí)際樣品檢測的要求等問題。核酸適配體就可以很好的解決這個(gè)問題。與傳統(tǒng)的分析方法相比，適配體具有如下特點(diǎn):(I)較高的選擇性，因此不需要對被測組分進(jìn)行分離，即不用對樣品進(jìn)行預(yù)處理。(2)結(jié)構(gòu)簡單，體積小，使用方便，特別是便攜式的免疫傳感器，非常有利于農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量的快速測定。(3)可實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線檢測，使食品加工過程的質(zhì)量控制變得簡便。(4)響應(yīng)速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，免疫傳感器制作成本低，且可反復(fù)使用。
[0004]基于微陣列電極的適配體傳感器具有較高靈敏度和較寬的線性響應(yīng)范圍。傳統(tǒng)的適配體傳感器通常是在普通電極上進(jìn)行檢測，是將金屬或非金屬直接浸入電解質(zhì)進(jìn)行阻抗測量，但是傳統(tǒng)電極表面的半無限線性擴(kuò)散層容易造成反應(yīng)物的損耗。為了提高檢測靈敏度，不同幾何形狀的微電極被廣泛使用。叉指陣列微電極(IDAM)具有阻抗降較低，能夠快速建立穩(wěn)態(tài)信號(hào)，提高信噪比的特點(diǎn)，但是由于電極的表面凹凸不平，金層較薄，不易清洗且容易損壞，在應(yīng)用中受到很大限制；本發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷以及操作簡單、靈敏度高、選擇性好的檢測四環(huán)素殘留的適配體傳感器的制備方法。將和抗生素特異性識(shí)別的適配體有效固定到微陣列電極表面，是提高適配體傳感器檢測抗生素殘留性能的關(guān)鍵?；谖㈥嚵须姌O的適配體傳感器的檢測方法具有攜帶方便、檢測快速準(zhǔn)確、操作簡單、可實(shí)現(xiàn)抗生素殘留的在線定性定量測量等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于抗生素殘留檢測的微陣列適配體傳感器制備方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下:一種叉指微陣列適配體傳感器的制備方法，是用堿酸交替清洗叉指微陣列電極，再利用離子液和四氧化三鐵分別修飾微陣列電極，然后將四環(huán)素適配體固定在修飾后的微陣列電極上，獲得叉指微陣列適配體傳感器，將四環(huán)素適配體傳感器用于牛奶中四環(huán)素殘留的現(xiàn)場快速檢測。
[0006]所述的離子液的制備方法如下:將4mg N-辛基吡啶六氟磷酸鹽(離子液體)分散于4mL無水乙醇中，超聲分散6h以得到穩(wěn)定的分散液，所獲得的高度分散懸浮液為lmg/mL離子液體溶液，將制備好的離子液體溶液在4°C下存儲(chǔ)。
[0007]所述的四氧化三鐵的制備方法如下:稱取ImL乙酸溶液于小燒杯中，加入10mL超純水配成1.0%乙酸溶液。在50mL乙酸溶液中加入0.1g殼聚糖，配成0.2%殼聚糖溶液。取4mL 0.2%殼聚糖溶液，加入Img四氧化三鐵粉末，超聲分散6h以上得到穩(wěn)定的分散液。
[0008]所述方法的步驟如下:
1)電極的清洗:將金叉指微陣列電極依次用氫氧化鈉和鹽酸浸泡清洗，鏡檢合格后吹干獲得清洗電極；
2)電極的修飾:將離子液和四氧化三鐵逐層滴加到步驟I)所得的清洗電極上，孵育后洗去多余離子液和四氧化三鐵，氮?dú)獯蹈?，獲得修飾電極；
3)四環(huán)素適配體的在微陣列電極表面的固定:在步驟2)所得的修飾電極上滴加四環(huán)素適配體，孵育后洗去多余適配體，氮?dú)獯蹈?，獲得適配體電極；
所述方法步驟I)所述用氫氧化鈉和鹽酸浸泡清洗，是將金叉指微陣列電極浸入到IM氫氧化鈉溶液中，浸泡15min，用擦鏡紙擦洗電極表面2min后用超純水沖洗干凈，再將電極浸入IM鹽酸溶液中，浸泡15min，用擦鏡紙擦洗電極表面2min后用超純水沖洗干凈并氮?dú)獯蹈桑?br> 所述方法步驟2)所述離子液和四氧化三鐵復(fù)合液滴加，滴加量為15~50 μ L ;所述孵育，溫度為22~25°C，時(shí)間為30~60min ；
所述方法步驟3)所述適配體為四環(huán)素適配體，滴加量為10~50yL，滴加濃度為5~10 μΜ ;所述孵育，溫度為4°C，時(shí)間為30~60min ；
所述方法的具體步驟如下:
I)電極的清洗:將金叉指微陣列電極浸入到IM氫氧化鈉溶液中，浸泡15min，用擦鏡紙擦洗電極表面2min后用超純水沖洗干凈，再將電極浸入IM鹽酸溶液中，浸泡15min，用擦鏡紙擦洗電極表面2min后用超純水沖洗干凈并氮?dú)獯蹈?，獲得清洗電極；
2)離子液修飾電極:在步驟I)所得的清洗電極表面滴加15μ L離子液，置于22~25°C環(huán)境下孵育30min后，用超純水沖洗電極工作區(qū)除去多余離子液，氮?dú)獯蹈珊螅@得離子液修飾電極；
3)四氧化三鐵修飾電極:在步驟2)所得的離子液修飾電極表面滴加15μ L四氧化三鐵，置于22~25°C環(huán)境下孵育30min后，用超純水沖洗電極工作區(qū)除去多余四氧化三鐵，氮?dú)獯蹈珊螅@得離子液-四氧化三鐵修飾電極；
4)適配體固定:在步驟3)所得的修飾電極上滴加1yL5μΜ的四環(huán)素適配體，于4°C環(huán)境下孵育30min后，用超純水沖洗電極表面，除去多余適配體溶液，氮?dú)獯蹈?，獲得適配體電極；
所述方法用于四環(huán)素殘留快速檢測適配體傳感器的制備。
[0009]本發(fā)明的一種用于抗生素殘留檢測的微陣列電極適配體傳感器制備方法，具體檢測方法如下:在使用前將微陣列電極表面使用離子液和四氧化三鐵納米材料進(jìn)行化學(xué)修飾，提高傳感器檢測的靈敏度，之后在微陣列電極表面固定四環(huán)素適配體。然后將微陣列電極放入冰箱中，4°C下保存?zhèn)溆?。使用時(shí)取出微陣列電極，滴涂上15yL 5 mM[Fe(CN)6J3^P 0.1 mo I/L KCl的pH7.0 PBS溶液，打開阻抗分析儀，設(shè)置阻抗測試的參數(shù):直流偏置電壓為0V，交流激勵(lì)電壓為55mV，測試頻率從IHz到100kHz。測量初始阻抗值A(chǔ)l，并保存。用超純水沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈?，在微陣列電極表面滴涂15yL四環(huán)素孵化30min，再將傳感器連接至阻抗分析儀進(jìn)行阻抗測量，獲取第二次測量的阻抗值A(chǔ)2，微控制器將其送至顯示屏顯示。計(jì)算出變化率，變化率計(jì)算公式如下:
ΔΑ=|Α1-Α2|/Α1
變化率和四環(huán)素濃度的線性關(guān)系為AA=22.600LogC(M)+217.26，相關(guān)系數(shù)為0.9745。根據(jù)ΔΑ可以相應(yīng)獲得四環(huán)素的濃度。
[0010]對該適配體傳感器在濃度為5 μΜ的鹽酸土霉素(0TC)、硫酸卡那霉素(KanamycinMonosulfate)與硫酸慶大霉素(Gentamycin Sulfate)等