一種檢測毒死蜱的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測農(nóng)藥殘留的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法與應(yīng)用，具體涉 及一種檢測農(nóng)藥毒死蜱的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 毒死蜱[chlorpyrifos，0,0-二乙基-0-(3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯] 是一種世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的高效殺蟲劑，可用在糧食、蔬菜、水果及經(jīng)濟作物的害蟲防 治，由于毒死蜱廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，在糧食、環(huán)境樣品等方面引起的殘留問題已有所 報道，對人們的健康構(gòu)成了潛在的威脅。目前，對藥物殘留的檢測主要方法是氣相色譜-質(zhì) 譜和液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法及酶聯(lián)免疫試驗，這些檢測方法須有高檔的檢測儀器且樣品前 處理復(fù)雜，酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)雖然可加快檢測的方法，但是檢測成本較高，檢測尚需要較高 的要求，無法實現(xiàn)大量樣品的快速現(xiàn)場檢測。而電化學(xué)免疫傳感器具有靈敏、快速、特異性 強、對樣品無需特殊處理的優(yōu)點，因此，近年來對于農(nóng)藥毒死蜱殘留的電化學(xué)免疫傳感器有 了較多的研宄應(yīng)用，F(xiàn)e 304電化學(xué)免疫傳感器的生物膜放在空氣中容易被氧化，保質(zhì)期短，貯 存條件不容易達到；例如現(xiàn)有技術(shù)CN201410142965. 4公開了一種檢測毒死蜱的免疫傳感 器的制備方法，是在經(jīng)過清洗、活化和性能測試的裸玻碳電極表面滴涂鎳鋁水滑石-石墨 烯復(fù)合液，然后用空殼納米金進行修飾，再在修飾后的電極上固定毒死蜱單克隆抗體，最后 用牛血清蛋白封閉，得到檢測毒死蜱的免疫傳感器，該發(fā)明制備的免疫傳感器具有靈敏度 高，成本低，檢測速度快，穩(wěn)定性好，且樣品回收率高的特點，適用于果蔬中毒死蜱殘留量的 快速檢測，

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種檢測毒死蜱的電化學(xué)免疫傳感器。
[0004] 本發(fā)明進一步所要解決的技術(shù)問題是，提供一種檢測毒死蜱的電化學(xué)免疫傳感器 的制備方法。
[0005] 本發(fā)明進一步所要解決的技術(shù)問題是，提供一種利用檢測毒死蜱的電化學(xué)免疫傳 感器檢測毒死蜱的方法。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種檢測毒死蜱的電化學(xué)免疫傳感 器，包括工作電極、參比電極、輔助電極，所述工作電極由基底電極表面依次固定萘酚膜，納 米四氧化三鈷/聚苯胺復(fù)合膜（nan〇-C 〇304/PAN)，毒死蜱人工抗原，并以牛血清蛋白（BSA) 封閉非特異性活性位點。
[0007] 進一步，所述基底電極為IT0玻璃電極，所述參比電極為Ag/AgCl電極，所述輔助 電極為鉑電極；所述毒死蜱人工抗原是毒死蜱人工免疫抗原或包被抗原。
[0008] 本發(fā)明進一步解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種檢測毒死蜱的電化學(xué)免疫 傳感器的制備方法，包括以下步驟：首先在預(yù)處理的基底電極表面滴加萘酚溶液，烘干；接 著滴加納米四氧化三鈷/聚苯胺復(fù)合材料，烘干；再滴加戊二醛溶液活化，清洗，氮氣吹干； 然后滴加毒死蜱人工抗原，分別孵育，過夜，清洗，烘干，最后滴加牛血清蛋白緩沖液封閉。
[0009] 進一步，所述檢測毒死蜱的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法包括以下步驟：
[0010] ⑴基底電極的預(yù)處理：將基底電極切成4X lcm，乙醇超聲清洗，烘干，用絕緣膠 將探頭面積封至lcm2,再依次用洗潔精、丙酮、乙醇、去離子水中各超聲清洗5~lOmin，氮 氣吹干，備用；
[0011] ⑵納米四氧化三鈷/聚苯胺復(fù)合材料的制備：將0. 3~0. 4g十六烷基三甲基溴 化銨溶解在45~55mL蒸餾水中，加入0. 2~0. 4g的四氧化三鈷納米顆粒，超聲分散、攪拌 4. 5~5. 5h后加入150~200 y L苯胺，持續(xù)攪拌0. 5~1. 5h，加入相當(dāng)于苯胺物質(zhì)的量 1. 5倍的檸檬酸，攪拌9. 5~10. 5h，加入與苯胺物質(zhì)的量等量的硫酸銨，繼續(xù)攪拌11. 5~ 12. 5h后停止反應(yīng)，將反應(yīng)后的產(chǎn)物進行抽濾，保留濾餅，依次用去離子水和無水乙醇多次 洗滌至濾液無色，將濾餅置于真空烘箱中60°C干燥4小時即得nan〇-C 〇304/PAN復(fù)合材料， 備用；
[0012] (3)基底電極的表面修飾：首先在步驟⑴備用的基底電極表面滴滴加50~ 60 yL 1.25%萘酚溶液，烘干；接著滴加100~120 yL 1:800稀釋的步驟（2)中備用的納 米鈷-四氧化三鈷/聚苯胺復(fù)合材料，烘干；再接著滴加100~120 y L 0. 25 %戊二醛溶液， 常溫下活化2~3h后，用水沖洗干凈并用氮氣吹干，然后滴加100~120 yL 1:1600稀釋 的毒死蜱人工抗原，分別于37°C下孵育3~4h，過夜，用0.0 lmol/L，pH7. 2~7. 6的PBS緩 沖液沖洗干凈，烘干；
[0013] (5)非特異性活性位點的封閉：將表面修飾后的基底電極滴加100~120 y L 5mg/ mL牛血清蛋白緩沖液放于37°C恒溫封閉5~6h，取出用0.0 lmol/L，pH7. 2~7. 6的PBS緩 沖液沖洗干凈，即得電化學(xué)免疫傳感器。
[0014] 本發(fā)明進一步解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種利用檢測毒死蜱的電化學(xué) 免疫傳感器檢測毒死蜱的方法，包括以下步驟：
[0015] (1)修飾工作電極：先將電化學(xué)免疫傳感器的工作電極滴加毒死蜱單克隆抗體溶 液和毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品組成的混合液，放于37°C下孵育50~70min，取出用0. 008~0. 012mol. I71 pH 7. 2~7. 6的PBS緩沖液反復(fù)沖洗干凈，隨后滴加納米銅棒標(biāo)記的IgG-HRP抗體， 37°C下孵育30~45min，取出用0? 008~0? 012mol. I71 pH 7. 2~7. 6的PBS緩沖液反復(fù) 沖洗干凈，備用；
[0016] ⑵建立工作曲線：將步驟⑴中修飾后的工作電極與參比電極、輔助電極分別插 入體積比為1 : 1 : 1，物質(zhì)的量之比滿足0.1 : 5 : 5的氯化鉀、亞鐵氰化鉀和鐵氰化鉀 混合成pH 7. 4緩沖液中組裝成的三電極系統(tǒng)，在不斷攪拌下加入相當(dāng)于毒死蜱單克隆抗 體溶液和毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品組成的混合液體積的0. 1倍的0. 4mol/L~0. 5mol/L的雙氧水，測 定不同濃度毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品的電流值，毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品濃度與相應(yīng)的電流值之間的函數(shù)關(guān)系， 即為電化學(xué)免疫傳感器工作曲線；
[0017] (3)測定毒死蜱：利用步驟（1)修飾后的工作電極在-0. 8~0. 8V的范圍內(nèi)進行 循環(huán)伏安掃描，測定毒死蜱待測溶液中的電流值，然后根據(jù)步驟（2)獲得的工作曲線，即可 計算出待測溶液中毒死蜱的濃度。
[0018] 進一步，步驟⑴中，所述納米銅棒標(biāo)記的IgG-HRP抗體是由用堿液調(diào)節(jié)CuNRs溶 液的pH至8~10,接著將體積比1:1的IgG-HRP和lmg/mLHRP混合液滴加入CuNRs溶液 中，攬樣 10 ~20min 后，在 8000 ~12000rpm 下離心 15 ~25min，然后用 O.Olmol/L pH 7.4 的PBS進行2~5次洗滌，最后將所得CuNRs-IgG-HRP分散在lml PBS緩沖液中制備而成。 [0019] 進一步，步驟（3)中，所述循環(huán)伏安掃描速率為50mV/s。
[0020] 本發(fā)明之檢測農(nóng)藥毒死蜱的電化學(xué)免疫傳感器將免疫化學(xué)的專一性和酶化學(xué)的 靈敏性融為一體，以四氧化三鈷作為納米材料，該原料易獲得，具有穩(wěn)定、標(biāo)記牢固、不干擾 抗原抗體反應(yīng)、樣品處理簡單、檢測速度快、攜帶便捷等優(yōu)點，并且c〇304的電化學(xué)免疫傳感 器的生物膜放在空氣中不容易被氧化，保質(zhì)期長，貯存條件容易達到，與大型儀器檢測技術(shù) 比，更適合于現(xiàn)場檢測，同時檢測多種低殘留的藥物，有望與生物芯片的高通量檢測技術(shù)結(jié) 合，從而創(chuàng)造快速、便捷、高效率、多殘留同時檢測的新型儀器，在檢測技術(shù)上是個劃時代的 突破。
【附圖說明】
[0021] 圖1為毒死蜱半抗原合成質(zhì)譜圖。
[0022] 圖2為毒死蜱人工抗原紫外全波長掃描圖。
[0023] 圖3為免疫電極的制備流程圖（以IT0玻璃電極為基礎(chǔ)，按上述步驟進行層層修 飾，制備出具有生物活性的免疫電極）。
[0024] 圖4為本發(fā)明毒死蜱檢測原理圖。
[0025] 圖5為循環(huán)伏安原理圖。
[0026] 圖6為本發(fā)明優(yōu)化曲線圖。
[0027] 圖7為毒死蜱電化學(xué)免疫傳感器工作曲線圖。
[0028] 圖8為本發(fā)明三角波電位掃描法實驗線路。其中，（a)是三種電極的連接形式，（b) 是三角波電位掃描實驗線路，通過G外控來實現(xiàn)對電路施加循環(huán)伏安法所需要的三角掃描 電壓。工作電極（WE)，參比電極（RE)和輔助電極（CE)。參比電極用來定點位零點，電流流 經(jīng)工作電極和輔助電極，工作電極和參比電極構(gòu)成一個不通或基本少通電的體系，利用參 比電極電位的穩(wěn)定性來測量工作電極的電極電勢。工作電極和輔助電極構(gòu)成一個通電的體 系，用來測量工作電極通過的電流。利用三電極測量體系，來同時研宄工作電極的點位和電 流的關(guān)系。
[0029] 圖9為循環(huán)伏安法驗證圖。其中，（a)裸電極；(b)萘酚修飾的電極；(c) nan〇-C 〇304/PAN修飾的電極；(d)抗原修飾的電極；（e)毒死蜱抗體修飾的電極；各修飾電 極在體積比為1:1:1的〇. lmol/L氯化鉀、5mmol/L亞鐵氰化鉀和5mmol/L鐵氰化鉀混合制 成1/15!11〇1.17 14117.4緩沖液中循環(huán)伏安掃描（〇0圖，實驗結(jié)果符合設(shè)計的原理，達到預(yù) 想。
[0030] 圖10為傳感器組裝圖。其中，（a)是總體布局圖；(b)是操作界面設(shè)計圖；（c)是 檢測池；⑷是檢測過程。（c)圖解釋：工作方式：通過選項卡，選擇其工作方式[包括：正 負(fù)極轉(zhuǎn)換，負(fù)載選擇，通斷路，自己設(shè)定等選項]。
[0031] 顯示區(qū)：主要顯示電流（量程0~lOOyA)，電壓（量程0~10v)
[0032] 校正區(qū)：通過空白值來校正電流，電壓表的數(shù)據(jù)顯示。（起校零的作用，扣除空白 值）。
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