電化學免疫傳感器及其制備方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測技術(shù)，特別涉及一種電化學免疫傳感器及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 電化學免疫傳感器（Electrochemical Immunosensor，ECIS)是一種集微生物學、 免疫學、物理學等多學科交叉的先進技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強、檢測快速方便和易實 現(xiàn)在線檢測等優(yōu)點，因此成為環(huán)境和食品安全檢測等多個領域中有害微生物快速檢測的研 宄熱點，應用前景廣闊。而以往的免疫傳感器多使用石墨烯、無序的碳納米管、介孔碳等材 料來制作電極，操作復雜易流失，性能不夠好，且在電子的傳輸速率上有一定的限制，拉伸 強度稍欠；同時，電極與生物分子的結(jié)合也多采用物理吸附法固定，反應過程中隨機導向問 題嚴重，特異選擇性不夠，且利用物理吸附法固定的生物分子與固體表面的結(jié)合不牢固，具 有易脫落、靈敏度差等缺點。因此，需要一種新型的電化學免疫傳感器來解決或減少這些問 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種電化學免疫傳感器及其制備方法，以獲得具有良好生 物相容性，高導電性，高穩(wěn)定性的納米電極材料，提高靈敏度，和檢測穩(wěn)定性，減少檢測時 間。
[0004] 本發(fā)明提供一種電化學免疫傳感器，包括復合碳納米管電極、免疫生物探針、待測 物。
[0005] 優(yōu)選的，所述的復合碳納米管為高導電率及雙向的基團改性的復合碳納米管；所 述的免疫生物探針包括電極和待結(jié)合物。
[0006] 優(yōu)選的，所述的雙向基團改性包括在碳納米管電極表面基團進行的羧基化和氨基 化改性；所述的高導電率的復合碳納米管是將碳納米管經(jīng)過Layer-by-Layer法層層組裝 成致密的導電膜后制備而成。
[0007] 優(yōu)選的，所述的待結(jié)合物為辣根過氧化物酶標記的具有生物活性的分子。
[0008] 本發(fā)明還提供一種電化學免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟：
[0009] (1)制備碳納米管電極：所用的羧基化碳納米管與氨基化碳納米管在調(diào)整pH為 2. 5-4. 5水中超聲處理1-3小時，形成碳納米管濃度為0. 5mg/ml的穩(wěn)定溶液；將電極基體 先浸沒于氨基化碳納米管溶液20-60分鐘，然后放入去離子水1-5分鐘1-2次，反復循環(huán)此 過程，直至獲得層疊的碳納米管電極；
[0010] (2)再構(gòu)筑碳納米管表面納米形貌：將步驟（1)中的碳納米管電極置于濃度為 5nm-100nm或者0? 01-10mg/ml的金溶膠中，并在-0? 7至+0? 7V的電壓下以電沉積方式將金 納米顆粒固定在碳納米管電極表面進行復合；
[0011] (3)制備免疫生物探針：用化學鍵共價交聯(lián)法將以上步驟獲得的碳納米管電極在 濃度為500mg/mL的1-乙基3-(3-二甲氨基）碳二亞胺鹽酸鹽，濃度為250mg/mL的N-羥基 硫代湖泊酰亞胺，濃度為0. 01-0. lmmol/L且pH值為7. 0-7. 4的磷酸鹽緩沖液中活化1到2 小時，磷酸鹽緩沖液洗滌2~3次；隨后將活化后的碳納米管電極置于含有1. 0-1. 8 y g/mL 的辣根過氧化物酶標記的副溶血性弧菌抗體或單增李斯特菌抗體的磷酸鹽緩沖液中反應3 小時，磷酸鹽緩沖液洗滌2~3次；然后將電極放在含有0. 2 % -2 %牛血清白蛋白的磷酸鹽 緩沖液封閉液中封閉1小時，洗滌2~3次，晾干后置4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br>[0012] (4)結(jié)合免疫生物探針與待測物：將免疫生物探針與副溶血性弧菌、單增李斯特 菌溶液在室溫下孵育，緩沖液洗滌2~3次，并在待測液中加入具有氧化還原特性的硫堇后 進行待測。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中是將已有銅電極的基板在氨基化碳管溶液和羧基化碳管 溶液中反復交替浸泡數(shù)次，獲得層層自組裝碳納米管電極。
[0014] 優(yōu)選的，所述步驟（2)中是將金納米顆粒固定在碳納米管電極表面進行復合。
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中是采用化學鍵共價交聯(lián)法，使待固定物上的基團與電極 表面的基團進行結(jié)合，形成化學鍵。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中還可在化學鍵共價交聯(lián)法的基礎上采用夾心法、競爭法、 間接法、直接法結(jié)合固定物。
[0017] 優(yōu)選的，所述步驟（4)中：
[0018] 采用三電極體系以循環(huán)伏安法作為免疫電極表征和定性判定的方法，以免疫反應 前、后還原峰電流下降的比例來判斷被測樣品中是否含有副溶血性弧菌或單增李斯特菌抗 原；或者采用電阻型生物探針，在不同濃度下，測量不同期電阻值的變換，獲得定量數(shù)據(jù)。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：通過Layer-by-Layer方法，形成層層自組裝的致密納米 結(jié)構(gòu)薄膜，并對薄膜進行改性，獲得具有良好生物相容性，高導電性，高穩(wěn)定性的納米電極 材料，提高靈敏度，和檢測穩(wěn)定性，減少檢測時間。使得導電率、比表面積等性能更優(yōu)越，且 具有一定的柔韌性；在改性時，官能團的密度可控，給生物分子與電極表面的結(jié)合量提供了 參考?；瘜W鍵共價結(jié)合法的應用克服了物理吸附法固定過程中的隨機導向問題嚴重，特異 選擇性不夠，生物分子與固體表面的結(jié)合不牢固，易脫落、靈敏度差等缺點。
【附圖說明】
[0020] 圖1為復合碳納米管電極的制備、生物分子固定及間接法、夾心法、競爭法三種方 法下抗體與電極表面的結(jié)合示意圖；
[0021] 圖2為免疫傳感器的電化學表征圖；
[0022] 圖3為化學鍵共價交聯(lián)法處理的傳感器的穩(wěn)定性測試圖；
[0023] 圖4為物理吸附固定法處理的傳感器的穩(wěn)定性測試圖；
[0024] 圖5為在不同pH緩沖液中免疫傳感器在加入雙氧水后的還原峰電流峰值的對比 圖；
[0025] 圖6為向測試液中加入不同濃度雙氧水前后還原峰電流峰值的對比圖。
【具體實施方式】
[0026] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下文中將結(jié)合實施例進行詳 細說明。
[0027] 本發(fā)明提供的電化學免疫傳感器，包括復合碳納米管電極、免疫生物探針、待測 物。所述的復合碳納米管為高導電率及雙向的基團改性的復合碳納米管；所述的免疫生物 探針包括電極和待結(jié)合物。所述的雙向基團改性包括在碳納米管電極表面基團進行的羧基 化和氨基化改性；所述的高導電率的復合碳納米管是將碳納米管經(jīng)過Layer-by-Layer法 層層組裝成致密的導電膜后制備而成。所述的待結(jié)合物為辣根過氧化物酶標記的具有生物 活性的分子。
[0028] 本發(fā)明還提供一種電化學免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟：
[0029] 步驟（1)，關(guān)于碳納米管電極的制備，所用的羧基化碳納米管（MWNT-COOH)與氨基 化碳納米管（MWNT-NH2)在調(diào)整pH為2. 5-4. 5水中超聲處理1-3小時，形成碳納米管濃度 為0. 5mg/ml的穩(wěn)定溶液。電極基體先浸沒于MWNT-NH2溶液20-60分鐘，然后放入去離子 水1-5分鐘1-2次，然后在放入到MWNT-C00H20-60分鐘，然后放入去離子水1-5分鐘1-2 次，然后浸沒于MWNT-NH2溶液20-60分鐘，后放入去離子水中，過程被不斷反復。反復循環(huán) 此過程，獲得良好層疊的layer-by-layer碳管膜電極。最終制得的碳納米管電極如圖1所 不〇
[0030] 步驟（2)，將沒有固定生物分子的電極室溫下在0. lmol/L、pH7. 0的含有硫堇的 PBS磷酸鹽測試液中進行電化學循環(huán)伏安法測試；洗滌后采用化學鍵共價交聯(lián)法將一定 量的酶標抗體固定在碳納米管電極表面，洗滌后將其在測試液中進行測試，然后加入〇. 5m mol/L過氧化氫反應，測試結(jié)束后洗滌；將104cfu/mL的副溶血性弧菌、單增李斯特菌溶液 與電極室溫下孵育，洗滌后測試即得到圖2。
[0031] 步驟（3)，選取表觀形貌相近的碳納米管電極，室溫下均置于各含有5yL的1-乙 基3-(3_二甲氨基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)、N-羥基硫代湖泊酰亞胺（NHS)的50 y L的PBS 緩沖混合液中活化兩個小時，洗滌；再把電極放置于含有一定量酶標抗體的PBS緩沖液中， 反應三個小時；洗滌后，用含有0. 2% BSA的PBS溶液封閉一小時，洗滌晾干后4°C保存待 測，得到表一中相應的數(shù)據(jù)。測試液為0. lmol/L、pH7. 0的含有硫堇的PBS磷酸鹽溶液，加 入的過氧化氫濃度為0. 5mmol/L。
[0032] 步驟（4)，選取表觀形貌相近的碳納米管電極，直接將與實施例2中相同量的酶標 抗體滴涂至電極表面，室溫下干燥成膜，洗滌晾干后4°C保存待測（實施例2、3中測試液 的體積及加入的過氧化氫的量均相同），測試后，得到表1中相應的數(shù)據(jù)。液為〇. lmol/L、 pH7. 0的含有硫堇的PBS磷酸鹽溶液，加入的過氧化氫濃度為0. 5mmol/L。
[0033]表1
[0035]步驟（5)，采用與上述操作相同的化學鍵共價交聯(lián)法、物理吸附法固定生物分子， 在測試液中進行循環(huán)測試，得圖4。測試液為0. lmol/L、pH7. 0的含有硫堇的PBS磷酸鹽溶 液。
[0036] 步驟（6)，取3個碳納米管電極室溫下分別置于有等量的EDC、NHS混合的PBS緩沖 混合液中活化兩個小時，洗滌；再把電極分別放置于含有4. 5 y L、13. 5 y L、22. 5 y L(濃度 均為1. 1 U g/mL)酶標抗體的PBS緩沖液中，反應三個小時，洗滌；用含有0. 2% BSA的PBS 溶液封閉，洗滌晾干后4°C過夜。待加入0. 5mmol/L過氧化氫測試后，用102cfu/mL的菌液 37°C孵育半小時，測試，得到表二中的數(shù)據(jù)。測試液為0. lmol/L、pH7. 0的含有硫堇的PBS 磷酸鹽溶液。
[0037] 步驟