用于檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的膠體金試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小麥矮腥黑粉菌防治領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的 膠體金試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥矮腥黑穗病是由小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn，TCK)引起的 重要國(guó)際檢疫性病害，也是我國(guó)對(duì)外檢疫的一類危險(xiǎn)性植物病害。該病害危害大、防治難， 一旦傳入會(huì)給小麥生產(chǎn)帶來(lái)毀滅性危害，通常發(fā)病率約等于小麥產(chǎn)量損失率。據(jù)Hoffmann 報(bào)告，在流行年份，因TCK引起的損失率一般為20 %~50 %，最高可達(dá)75 %~90 %。除了 產(chǎn)量損失外，被侵染的小麥出粉率也會(huì)隨著感染嚴(yán)重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子 而極大地影響品質(zhì)。小麥矮腥黑粉菌對(duì)我國(guó)的小麥生產(chǎn)存在潛在危機(jī)，該病在栽培條件下 的主要寄主為冬小麥，我國(guó)常年小麥種植面積約2300萬(wàn)hm2,其中冬小麥占絕大部分，西 北、黃淮海等廣大冬麥區(qū)均適合小麥矮腥黑粉菌的定殖和發(fā)生危害，隨著我國(guó)加入WT0及 與TCK疫區(qū)國(guó)家-美國(guó)小麥貿(mào)易的增加，TCK傳入我國(guó)的可能性日益增大，因此，必須加強(qiáng) 對(duì)小麥矮腥黑穗病進(jìn)行檢疫檢測(cè)，為病害防治提供技術(shù)儲(chǔ)備。
[0003] 目前對(duì)小麥矮腥黑粉菌的檢測(cè)主要采用PCR方法，該方法通過(guò)設(shè)計(jì)小麥矮腥黑粉 菌的特異引物，以待測(cè)樣品的DNA為模板，在嚴(yán)格的擴(kuò)增條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，能夠準(zhǔn)確判 斷待測(cè)樣品中是否含有小麥矮腥黑粉菌。然而，該方法步驟繁瑣，從取樣到獲得結(jié)果需要一 天時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且需要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。因此，需要開(kāi)發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè) 小麥矮腥黑粉菌的方法，可以隨時(shí)檢測(cè)待測(cè)植株是否感染了小麥矮腥黑粉菌，從而對(duì)小麥 矮腥黑穗病進(jìn)行早期預(yù)警。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的不足和需求，提供一種用于檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的膠 體金試紙條及其檢測(cè)方法，該方法適用于各種環(huán)境，操作簡(jiǎn)便易行，能夠快速準(zhǔn)確地判斷待 測(cè)樣品是否感染小麥矮腥黑粉菌。
[0005] 本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案如下：
[0006] 抗小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCC No. 10883的雜交瘤細(xì)胞所分 泌。
[0007] 分泌抗小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCC No.10883。
[0008] 用于檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的膠體金試紙條，包括樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜、吸水紙和 PS底板；所述樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水紙按樣品層析方向依次設(shè)置于PS底板上；
[0009] 其特征在于：所述金標(biāo)墊上包被有膠體金標(biāo)記的權(quán)利要求1所述的抗小麥矮腥黑 粉菌的單克隆抗體；
[0010] 所述NC膜上按樣品層析方向依次包括檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線上包被有滅 活的小麥矮腥黑粉菌孢子；所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠二抗。
[0011] 所述金標(biāo)墊上的抗體包被濃度為0. 096ug/cm。
[0012] 所述NC膜檢測(cè)線上的抗原蛋白的包被濃度為1. 5mg/ml。
[0013] 所述NC膜質(zhì)控線上包被的抗體為羊抗鼠二抗，其包被濃度為0.5mg/ml。
[0014]用于檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求3~6所述的膠體金 試紙條按照下列步驟進(jìn)行檢測(cè)：
[0015] (1)將待測(cè)樣品滴加在樣本墊上；
[0016] (2)待質(zhì)控線顯色后，觀察檢測(cè)線是否由無(wú)色變成紅色；若檢測(cè)線變成紅色，則待 測(cè)樣品中不含有小麥矮腥黑粉菌；若檢測(cè)線不變色，則待測(cè)樣品中含有小麥矮腥黑粉菌。
[0017] 本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的抗小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體，其亞型為IgGl型，能夠特異 識(shí)別小麥矮腥黑粉菌的孢子。該抗體由保藏號(hào)為CGMCC No. 10883的雜交瘤細(xì)胞所分泌，其 效價(jià)高、親和力強(qiáng)、特異性好，與常見(jiàn)的小麥銹病無(wú)交叉反應(yīng)，可用于檢測(cè)樣品是否含有小 麥矮腥黑粉菌。
[0018] 本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)分泌抗小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏 號(hào)為 CGMCC No. 10883。
[0019] 本發(fā)明提供用于檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的膠體金試紙條，包括樣品墊、金標(biāo)墊、NC 膜、吸水紙和PS底板，利用膠體金夾心法檢測(cè)樣品中是否存在小麥矮腥黑粉菌。其檢測(cè)原 理為：樣品滴加在樣品墊上后，便朝著吸水紙的方向泳動(dòng)，金標(biāo)墊上膠體金標(biāo)記的抗小麥矮 腥黑粉菌的單克隆抗體（金標(biāo)抗體）溶解，若樣品中沒(méi)有小麥矮腥黑粉菌，那么當(dāng)金標(biāo)抗體 到達(dá)NC膜上的檢測(cè)線時(shí)，金標(biāo)抗體被檢測(cè)線上包被的滅活的小麥矮腥黑粉菌孢子捕獲，沉 積下來(lái)使檢測(cè)線變成紅色，多余的金標(biāo)抗體繼續(xù)向前泳動(dòng)，被質(zhì)控線上的羊抗鼠二抗捕獲， 使質(zhì)控線呈現(xiàn)紅色。若樣本中含有小麥矮腥黑粉菌，則金標(biāo)抗體與小麥矮腥黑粉菌孢子結(jié) 合后向前泳動(dòng)，越過(guò)檢測(cè)線，在質(zhì)控線上被羊抗鼠二抗捕獲，使質(zhì)控線呈現(xiàn)紅色，而檢測(cè)線 不變色。只有當(dāng)質(zhì)控線呈現(xiàn)紅色時(shí)，該檢測(cè)結(jié)果才有效。
[0020] 本發(fā)明還提供用于檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的方法，該方法操作簡(jiǎn)單易行，只需將病 菌孢子用0. 02mol/l PBS緩沖液處理后，滴加在本發(fā)明試紙條的樣本墊上，室溫反應(yīng)約 5-10min后，待質(zhì)控線顯色后，觀察檢測(cè)線是否由無(wú)色變成紅色；若檢測(cè)線變紅，則表明待 測(cè)樣品中不含有小麥矮腥黑粉菌或者待測(cè)植株未感染小麥矮腥黑粉菌；若檢測(cè)線不變色， 則待測(cè)樣品中含有小麥矮腥黑粉菌或者待測(cè)植株感染了小麥矮腥黑粉菌。采用本發(fā)明試 紙條進(jìn)行檢測(cè)，不需要儀器設(shè)備，在實(shí)驗(yàn)室和野外均可進(jìn)行，從取材到獲得檢測(cè)結(jié)果僅需15 分鐘，操作十分輕松，能夠?qū)π←湴群谒氩∵M(jìn)行早期預(yù)警，以便及時(shí)采取防治措施，大大 減少病害造成的損失。
[0021] 生物保藏信息：
[0022] 生物材料名稱：TCK-2_2
[0023] 分類命名：對(duì)小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株
[0024] 保藏日期：2015年06月05日
[0025]保藏號(hào)：CGMCC No. 10883
[0026] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0027] 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋和說(shuō)明，需要聲明的是，下述實(shí)施例僅作 為舉例說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 生物材料
[0030] 小麥矮腥黑粉菌：已知菌種，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研宄所麥類病害研宄組。
[0031] 葉銹菌THT:已知菌種，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研宄所麥類病害研宄組。試劑與 溶液：
[0032]HAuCL4(進(jìn)口，sigma)，BSA(進(jìn)口，巴斯夫或sigma)，PEG (20000)，二氯二甲硅烷 + 氯仿，各種普通化學(xué)藥品，表面活性劑，緩沖溶液若干。
[0033] 標(biāo)準(zhǔn)品：黑粉菌孢子（濃度：1000ppm)
[0034] 主要材料儀器：
[0035] 劃膜儀（biodot XYZ3060);膠體金顆粒（北京勤邦生物技術(shù)有限公司）；電磁加熱 攪拌套式恒溫器；洄流圓形燒瓶；蛇型冷凝管；攪拌子；分光光度計(jì)；高速冷凍離心機(jī)；烘 箱；切條機(jī)（biodot CM4000);除濕機(jī)；封口機(jī)；NC膜（whatman FF120);膠體金墊（聚醋膜 whatman);樣品墊（玻璃纖維whatman，S2樣品墊（處理液成分是：以0? 02mol/l PBS為母 液分別添加0.5% tween 20, 2%蔗糖，2% BSA);吸水紙、PS(國(guó)產(chǎn)進(jìn)口皆可）。
[0036] 實(shí)施例1、小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體的獲得
[0037] -、雜交瘤細(xì)胞的制備
[0038] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c小鼠，由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。
[0039] 1、抗原制備
[0040] 用小麥矮腥黑粉菌孢子作為免疫原，按常規(guī)的小鼠免疫方法對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。
[0041] 2、制備雜交瘤細(xì)胞
[0042] (1)挑選小麥矮腥黑粉病血清檢測(cè)較好的小鼠，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，同時(shí)準(zhǔn)備SP2/0骨 髓瘤細(xì)胞，放在37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，加強(qiáng)免疫3天后進(jìn)行融合。
[0043] (2)取已經(jīng)免疫小麥矮腥黑粉菌的的BALB/c小鼠，通過(guò)頸脫位致死小鼠，浸泡于 75%酒精中5分鐘。將小鼠取出晾干，放入超凈工作臺(tái)中，剪開(kāi)外皮，暴露出腹腔的上皮，在 脾臟處將上皮剪開(kāi)小口，取出脾臟，放入培養(yǎng)皿中，用注射器吸取不完全培養(yǎng)液，打到脾臟 里面，吹出脾細(xì)胞，如此反復(fù)，直至脾臟吹至透明為止。
[0044] (3)用吸管將SP2/0從瓶壁上吹下，再將SP2/0懸液全部移到上述脾細(xì)胞懸液中， 把離心管蓋子擰緊。室溫l〇〇〇r/min離心5min。離心好后倒掉上清，用吸水紙將流動(dòng)液體 吸干，混勻細(xì)胞，加入融合劑，2分鐘后緩慢加入不完全培養(yǎng)液進(jìn)行終止融合。室溫1000r/ min離心5min，棄掉上清，加入HAT培養(yǎng)液進(jìn)行鋪板培養(yǎng)。
[0045] (4)用間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)融合細(xì)胞的陽(yáng)性率，一共有6個(gè)孔對(duì)黑粉菌有陽(yáng) 性反應(yīng)，然后經(jīng)有限稀釋對(duì)檢測(cè)出的6個(gè)孔的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞分別進(jìn)行克隆，篩選得到1個(gè) 對(duì)黑粉菌陽(yáng)性顯色較高的細(xì)胞株，將其擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。
[0046] 獲得了穩(wěn)定分泌抗小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其細(xì)胞株編號(hào) 為：1E3,送中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為：CGMCC No.10883。
[0047] 二、單克隆抗體制備
[0048] 1、采用體內(nèi)誘生法大量制備單克隆抗體。
[0049] (1)制備腹水前注意觀察，雜交瘤細(xì)胞（CGMCC No. 10883)生長(zhǎng)飽滿，狀態(tài)良好，占 總體積的70%即可進(jìn)行抗體制備。準(zhǔn)備好離心管，用無(wú)菌的滴定管小心吹打細(xì)胞瓶底部，使 細(xì)胞從瓶底脫落，此動(dòng)作重復(fù)10次左右，將吹好的細(xì)胞無(wú)菌轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)1000轉(zhuǎn)/min 離心5min，小心將離心的上清倒掉，向離心管中加入DMEM，將細(xì)胞混勻，吸入注射器中，注 入已經(jīng)注射石蠟油的小鼠體內(nèi)。
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