生長激素的禁食水平作為心血管風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物的制作方法
【專利說明】生長激素的禁食水平作為心血管風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明的主題是預(yù)測(cè)受試者的心血管風(fēng)險(xiǎn)或總體死亡風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括：
[0002] ?確定獲自所述受試者的體液中的生長激素（hGH)和/或其同工型的禁食水平； 以及
[0003] ?將所述生長激素（hGH)和/或其同工型的禁食水平與心血管風(fēng)險(xiǎn)或總體死亡風(fēng) 險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，其中增加的水平預(yù)測(cè)為增加的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 生長激素（hGH)是從垂體腺前葉分泌的，并且其許多但不是所有的代謝作用是通 過IGF-1發(fā)揮的，{1}。除了在兒童和青少年時(shí)期調(diào)節(jié)縱向骨生長，hGH在整個(gè)生命中發(fā)揮 代謝作用，如在合成代謝狀態(tài)中，與胰島素起作用刺激IGF-1導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成和合成代謝。 在分解代謝狀態(tài)中，hGH刺激脂解作用并從而防止蛋白質(zhì)降解和糖原存儲(chǔ)的耗竭{1}。在最 近幾十年，hGH在成人心血管系統(tǒng)中的作用已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注，主要在hGH不足和 hGH過量的情況下。
[0006] 已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腦垂體機(jī)能減退的成人具有增加的心血管和腦血管疾病死亡率，并且 這很大程度上{2}，{3}，{4}但不是完全{5}歸因于生長激素不足（GHD)。當(dāng)將患有GHD的 患者與健康個(gè)體進(jìn)行比較時(shí)，GHD-患者已經(jīng)被證實(shí)具有不良心血管風(fēng)險(xiǎn)特征：升高的低密 度脂蛋白膽固醇（LDL-C) {6}，{7}、體重指數(shù)（BMI) {6}和腰臀比{6}，{8}和降低的高密度脂 蛋白膽固醇（HDL-C) {4}。給這些患者進(jìn)行hGH替代療法已經(jīng)對(duì)心血管風(fēng)險(xiǎn)特征的幾個(gè)方面 顯示出有利的影響，例如降低CRP、體脂、腰臀比、軀干脂肪和增加的HDL-C{9}，{6}，{10}以 及降低的LDL-C和舒張壓{11}。盡管對(duì)葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用可能是負(fù)面的{11}，{1}，在這 種背景下可以試驗(yàn)性地假設(shè)hGH替代是有益的，但是迄今為止，沒有大的安慰劑對(duì)照、隨機(jī) 前瞻性研宄證實(shí)hGH替代對(duì)心血管發(fā)病率或死亡率的作用。
[0007] 另一方面，肢端肥大癥患者（其遭受過量分泌的生長激素）也顯示心血管和腦血 管疾病中升高的死亡率{12}。該死亡率的促成因素被發(fā)現(xiàn)為高血壓、糖尿病、與心臟肥大有 關(guān)的心律失常和心肌病的較高的流行{13}，{14}。在這些患者中用促生長素抑制素類似物 抑制hGH分泌，已經(jīng)對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和行為表現(xiàn)顯示出有益的作用{15}。hGH過量的有害作用 是通過Takala等在1999年的研宄得到進(jìn)一步證實(shí)的，其中與施用安慰劑相比，施用高劑量 hGH的重癥監(jiān)護(hù)病房中的危重病人死亡率翻了一番{16}。
[0008] 大多數(shù)文獻(xiàn)關(guān)注hGH過量或者不足的患者。但是對(duì)法國警察的前瞻性研宄開始于 60年代末和70年代初并伴隨18年隨訪，檢查了 hGH的禁食值和過早死亡的風(fēng)險(xiǎn)。他們的發(fā) 現(xiàn)表明，口服葡萄糖耐量測(cè)試2h之后，較高的hGH水平與所有原因的過早死亡和心血管疾 病的升高的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，禁食hGH(用標(biāo)準(zhǔn)hGH測(cè)試測(cè)量）對(duì)于死亡率的預(yù)測(cè)并不顯著{17}。 使用〇. 5ng/ml的截?cái)嘀?，Maison等發(fā)現(xiàn)1. 79的危害風(fēng)險(xiǎn)增加了 18年的心臟病死亡率。
[0009] hGH在一天的大部分時(shí)間以脈沖形式釋放的事實(shí)，阻礙了血漿hGH濃度的準(zhǔn)確解 釋，并且在早晨的時(shí)間中當(dāng)血漿濃度相對(duì)穩(wěn)定時(shí){32}，{33}，{34}，使用常規(guī)hGH測(cè)定hGH濃 度低，并且有時(shí)無法檢測(cè)到。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明的主題是用于血漿hGH測(cè)量（hGH)的新的超靈敏測(cè)定法，其還具有在低hGH 血漿濃度的準(zhǔn)確測(cè)量（例如測(cè)定靈敏度2pg/ml)。本發(fā)明的主題是心血管發(fā)病率和死亡率 的發(fā)展與受試者中禁食血漿中的hGH的相關(guān)性。本發(fā)明的主題是受試者中禁食血漿中的 hGH與冠狀動(dòng)脈疾?。–AD)、中風(fēng)、所有原因（總）死亡和心血管（CVD)死亡的風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。
[0012] 本發(fā)明的主題是預(yù)測(cè)受試者的心血管風(fēng)險(xiǎn)或總體死亡風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括：
[0013] ?確定獲自所述受試者的體液中的生長激素（hGH)和/或其同工型的禁食水平； 以及
[0014] ?將所述生長激素（hGH)和/或其同工型的禁食水平與心血管風(fēng)險(xiǎn)或總體死亡風(fēng) 險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，其中增加的水平預(yù)測(cè)為增加的風(fēng)險(xiǎn)。
[0015] 心血管風(fēng)險(xiǎn)或總死亡風(fēng)險(xiǎn)是指在一定的時(shí)間段內(nèi)由于心血管原因獲得事件的風(fēng) 險(xiǎn)或由于所有原因垂死的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述時(shí)間段是20年內(nèi)、或15年 內(nèi)、或10年內(nèi)、或5年內(nèi)、或2. 5年內(nèi)。
[0016] 本發(fā)明的主題是預(yù)測(cè)受試者在10年內(nèi)、或5年內(nèi)、或2. 5年內(nèi)的心血管風(fēng)險(xiǎn)或總 死亡風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括：
[0017] ?確定獲自所述受試者的體液中的生長激素（hGH)和/或其同工型的禁食水平； 以及
[0018] ?將所述生長激素（hGH)和/或其同工型的禁食水平與心血管風(fēng)險(xiǎn)或總死亡風(fēng)險(xiǎn) 相關(guān)聯(lián)，其中增加的水平預(yù)測(cè)為增加的風(fēng)險(xiǎn)，
[0019] 其中所述心血管風(fēng)險(xiǎn)被定義為不良事件或總死亡率風(fēng)險(xiǎn)，并且其中從所述受試者 取得所述體液之后預(yù)測(cè)10年內(nèi)、或5年內(nèi)、或2. 5年內(nèi)的所述不良事件的風(fēng)險(xiǎn)或總死亡風(fēng) 險(xiǎn)。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者在測(cè)量時(shí)為健康受試者，或者在測(cè)量時(shí)為沒有患 心血管疾病的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，在測(cè)量時(shí)，所述受試者從未患有中風(fēng)和/或心肌 梗塞和/或急性心臟衰竭。在一個(gè)實(shí)施方案中，在測(cè)量時(shí)，所述受試者從未有冠狀動(dòng)脈疾病 (CAD)和/或缺血性心臟疾病和/或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù) (CABG)〇
[0021] 總死亡風(fēng)險(xiǎn)是由于所有原因垂死的風(fēng)險(xiǎn)，是在一定時(shí)間段內(nèi)死亡的風(fēng)險(xiǎn)。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述心血管風(fēng)險(xiǎn)被定義為選自包含中風(fēng)、 CVD (心血管疾?。┧劳龊桶旅曰蚍侵旅孕募」Ｈ墓跔顒?dòng)脈疾病（CAD)、由于缺 血性心臟疾病的死亡、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG)的組的 事件。在一個(gè)實(shí)施方案中，CVD(心血管疾?。┧劳鍪怯捎谛募」Ｈ⒓毙孕呐K衰竭或中風(fēng) 的死亡。這意味著CVD(心血管疾?。┧劳鍪怯捎谛难芗膊〉乃劳?。在一個(gè)具體的實(shí)施 方案中，CVD(心血管疾?。┻x自包含心肌梗塞、急性心臟衰竭和中風(fēng)的組。
[0023] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述心血管風(fēng)險(xiǎn)或總死亡風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)是所述風(fēng)險(xiǎn)的短 期預(yù)測(cè)。
[0024] 那意味著在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)了受試者在短期內(nèi)獲得與心血管風(fēng)險(xiǎn)有 關(guān)的事件或由于所有原因垂死（總死亡）的風(fēng)險(xiǎn)，其中所述短期意味著10年內(nèi)、更具體5 年內(nèi)、更具體2.5年內(nèi)。
[0025] 本發(fā)明的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，通過確定體液中生長激素（hGH)和/或其同工型的 禁食水平，心血管風(fēng)險(xiǎn)或總死亡風(fēng)險(xiǎn)的短期預(yù)后是可能的。短期意味著從所述受試者取得 所述體液之后10年內(nèi)、或5年內(nèi)、或2. 5年內(nèi)。
[0026] 在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，CVD死亡的預(yù)測(cè)是短期預(yù)測(cè)。那意味著在一個(gè)更具 體的實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)所述受試者短期內(nèi)由于心肌梗塞、急性心臟衰竭或中風(fēng)的垂死風(fēng)險(xiǎn)， 其中所述短期意味著10年內(nèi)、更具體5年內(nèi)、更具體2. 5年內(nèi)。
[0027] 在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，CVD死亡的預(yù)測(cè)是針對(duì)男性受試者的短期預(yù)測(cè)。那 意味著在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)了所述男性受試者短期內(nèi)由于心肌梗塞、急性心 臟衰竭或中風(fēng)的垂死風(fēng)險(xiǎn)，其中所述短期意味著10年內(nèi)、更具體5年內(nèi)、更具體2. 5年內(nèi)。
[0028] 生長激素（hGH)的同工型可以選自包括hGH同工型l(22KD)、hGH同工型2、hGH同 工型3和hGH同工型4的組。
[0029] 同工型的序列：
[0030] SEQIDNO. 1:hGH同工型 1 (22KD)
[0031] MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEA
[0032] YIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVY GASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDD
[0033] ALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
[0034] SEQIDNO. 2:hGH同工型 2
[0035] MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFNPQ
[0036] TSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLE EGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKD
[0037] MDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
[0038] SEQIDNO.3:hGH同工型3
[0039] MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEA
[0040] YIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQ TYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
[0041] SEQIDNO.4:hGH同工型4
[0042] MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEA
[0043] YIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQIFKQTYSKFDTN SHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
[0044] 生長激素（hGH)的禁食水平是指在禁食的受試者的血液、血清或血漿中所確定的 生長激素（hGH)的水平。（在取樣之前12h沒有攝取食物）。禁食的受試者是指在取樣之 前12h受試者沒有進(jìn)行食物攝取。
[0045] 如本文所使用的術(shù)語"受試者"是指活的人類或非人類生物體。本文優(yōu)選所述受 試者為人類受試者。如果沒有另外指明，所述受試者可以是健康的或患病的。術(shù)語"升高的 水平"是指高于某一閾值水平的水平。
[0046] 體液可以選自包含血液、血衆(zhòng)、血清、唾液、尿液和腦脊液的組。在一個(gè)具體的實(shí)施 方案中，所述體液選自包含血液、血漿和血清的組。
[0047] 測(cè)定靈敏度可以由"分析"測(cè)定靈敏度進(jìn)行定義，所述"分析"測(cè)定靈敏度定義為 例如20個(gè)耗盡hGH的樣品的測(cè)定（determination)+2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)在中位數(shù)（median) 信號(hào)處的hGH濃度（標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù)）。
[0048] 備選地，所述測(cè)定靈敏度可以由"功能"測(cè)定靈敏度進(jìn)行定義，所述"功能"測(cè)定靈 敏度更多反映臨床常規(guī)中的檢測(cè)極限。所述功能測(cè)定靈敏度定義為在各種具有不同的hGH 濃度的個(gè)體樣品中血漿（患者樣品）的批間（inter assay)變異系數(shù)（CV)的測(cè)定。所述 功能測(cè)定靈敏度是具有小于20%的批間CV的最低hGH濃度。
[0049] 測(cè)定靈敏度可以取決于所使用的校準(zhǔn)方法和所使用的hGH測(cè)定。不同的hGH測(cè)定 可以檢測(cè)不同組的hGH同工型，導(dǎo)致不同的定量結(jié)果意味著導(dǎo)致不同的閾值和靈敏度需要 取決于所使用的測(cè)定和校準(zhǔn)方法。
[0050] 為了克服不同的hGH測(cè)定的這種可能的異質(zhì)性，測(cè)定校準(zhǔn)可以通過關(guān)聯(lián)個(gè)體受試 者的血漿hGH值進(jìn)行糾正。如果關(guān)聯(lián)曲線的斜率不為l，hGH值（所述校準(zhǔn)）可以通過導(dǎo)致 可比校準(zhǔn)、可比靈敏度分析和可比閾值的差別因子（differential factor)進(jìn)行校正。
[0051] 可以進(jìn)行上述校正以比較由不同測(cè)定所獲得的結(jié)果。
[0052] 在實(shí)施例1中描述的測(cè)定主要識(shí)別hGH同工型1，并通過重組人生長 激素（NIBSC碼 98/574,NationalInstituteforBiologicalStandardsand Control,Herfordshire,UK)進(jìn)行校準(zhǔn)。
[0053] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方法中，體液中所述生長激素（hGH)和/或其同工型的 禁食水平通過超靈敏測(cè)定法來進(jìn)行確定，所述超靈敏測(cè)定法具有小于l〇〇pg/ml、優(yōu)選小于 50pg/ml、優(yōu)選小于30pg/ml、優(yōu)選小于20pg/ml、優(yōu)選小于10pg/ml、優(yōu)選小于5pg/ml、優(yōu)選 為2pg/ml的分析測(cè)定靈敏度（其定義為如20個(gè)耗盡hGH的樣品的測(cè)定+2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD) 在中位數(shù)信號(hào)處的hGH濃度）。hGH的測(cè)量表示為ng/ml (lng/ml = 2. 6mU/L)。
[0054] 備選地，所述超靈敏測(cè)定法具有小于400pg/ml、優(yōu)選小于200pg/ml、優(yōu)選小于 120pg/ml、優(yōu)選小于80pg/ml、優(yōu)選小于40pg/ml、優(yōu)選小于20pg/ml、優(yōu)選為10pg/ml、最優(yōu) 選小于8. 5pg/ml的功能測(cè)定靈敏度（參見上文）。hGH的測(cè)量表示為ng/ml。
[0055] 我們使用重組人生長激素（NIBSC碼 98/574,NationalInstitutefor BiologicalStandardsandControl,Herfordshire,UK)用于免疫和用于校準(zhǔn)。
[0056] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如實(shí)施例1中所述進(jìn)行所述測(cè)定。
[0057] 所述測(cè)定可以特異性針對(duì)一個(gè)具體的hGH同工型，或者可以特異性針對(duì)并確定多 于一個(gè)或所有分泌的hGH異構(gòu)體，所述體液中所述分泌的hGH異構(gòu)體選自包含hGH同工型 1、同工型2、同工型3和同工型4(參見SEQID.NO: 1-4)的組。
[0058] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行所述方法多于一次，以監(jiān)測(cè)受試者 的心血管風(fēng)險(xiǎn)，或以監(jiān)測(cè)治療的進(jìn)程。
[0059] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行所述監(jiān)測(cè)以評(píng)估所述受試者對(duì)所采 取的預(yù)防和/或治療措施的反應(yīng)。
[0060] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述方法以將所述受試者分級(jí)為風(fēng) 險(xiǎn)組，和/或針對(duì)最高的經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物對(duì)所述受試者進(jìn)行重新分類。
[0061] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者為男性并且其中閾值為從高于400pg/ ml、優(yōu)選340pg/ml至100pg/ml、優(yōu)選60pg/ml，其中高于400pg/ml、優(yōu)選340pg/ml的閾值的 生長激素（hGH)和/或其同工型的禁食水平預(yù)測(cè)為高風(fēng)險(xiǎn)，并且低于100pg/ml、優(yōu)選60pg/ ml的閾值的禁食水平預(yù)測(cè)為低風(fēng)險(xiǎn)。
[0062] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者為女性并且其中閾值為從3150pg/ml 優(yōu)選至400pg/ml，其中高于3150pg/ml的閾值的生長激素（hGH)和/或其同工型的禁食水 平預(yù)測(cè)為高風(fēng)險(xiǎn)，并且低于400pg/ml的閾值的禁食水平預(yù)測(cè)為低風(fēng)險(xiǎn)。
[0063] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述心血管疾病選自：心肌梗塞、急性心臟衰竭和中 風(fēng)。
[0064] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)臨床參數(shù)由選自包含年齡、存在糖尿病、當(dāng)前吸煙 的組另外確定。