一種快速判定含油微生物細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸含量的方 法，尤其涉及一種適用于菌種篩選、微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化和工業(yè)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸微生 物培養(yǎng)過(guò)程監(jiān)測(cè)的快速判定細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多不飽和脂肪酸(主要包括DHA，EPA，ARA等）具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和正常生長(zhǎng)、預(yù)防 也血管疾病、免疫調(diào)節(jié)和抗癌等許多重要的生理作用。多不飽和脂肪酸已經(jīng)長(zhǎng)期作為嬰幼 兒奶粉、保健食品、藥品中的重要添加劑使用，近年來(lái)也開(kāi)始在食用油、奶制品等食品中作 為添加劑提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。早期多不飽和脂肪酸主要來(lái)源于深海魚(yú)油，受過(guò)度捕揚(yáng)、環(huán)境污 染、季節(jié)變化等因素的影響很大。而微生物來(lái)源的多不飽和脂肪酸則具有生產(chǎn)周期短、不受 季節(jié)和場(chǎng)地的影響、不受自然環(huán)境污染影響等特點(diǎn)，逐漸成為替代深海魚(yú)油的多不飽和脂 肪酸的主要生產(chǎn)來(lái)源，并廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和工業(yè)化生產(chǎn)。生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的微生 物包括微藻、細(xì)菌、真菌、酵母等，該些微生物通常W生產(chǎn)某一種多不飽和脂肪酸為主；如裂 殖壺藻通常高產(chǎn)DHA，希瓦氏菌高產(chǎn)EPA，高山被抱霉高產(chǎn)ARA等。
[0003] 生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的微生物通常從自然環(huán)境中分離純化(菌株篩選）得到，并通 過(guò)發(fā)酵工程等方法進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化和放大培養(yǎng)等，最終用于大規(guī)模工業(yè)化 生產(chǎn)。在菌株篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化、工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，需要對(duì)微生物中多不飽和脂肪酸的 含量進(jìn)行測(cè)定，W達(dá)到提高產(chǎn)量或監(jiān)測(cè)生產(chǎn)過(guò)程的目的。目前測(cè)定脂肪酸組成的方法通常 需要首先提取油脂，然后使用GC、GC-MS、HPLC或NMR等方法測(cè)定油脂中脂肪酸的組成和含 量。該些方法所需要的樣品通常需要通過(guò)溶劑提取和衍生化等復(fù)雜的步驟進(jìn)行制備，不但 耗時(shí)長(zhǎng)，而且可能對(duì)檢測(cè)精度產(chǎn)生影響，造成較大的誤差。因此，尋找簡(jiǎn)單快速測(cè)定不飽和 脂肪酸的方法，對(duì)于菌株篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化、工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中大批量樣品檢測(cè)具有重要 的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)微生物細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸含量的方法。 該方法利用微生物自身能夠高產(chǎn)油脂并形成脂滴該一特性，直接使用細(xì)胞進(jìn)行核磁共振檢 巧IJ，通過(guò)核磁共振譜圖上飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的特征峰的強(qiáng)度比，判定細(xì)胞內(nèi)多不 飽和脂肪酸相對(duì)含量。本方法和傳統(tǒng)脂肪酸含量測(cè)定方法相比，無(wú)需樣品干燥、細(xì)胞破碎、 油脂提取、轉(zhuǎn)醋化等操作，無(wú)需使用有機(jī)溶劑，節(jié)約了人力物力，大大提高了測(cè)定效率。
[0005] 本發(fā)明技術(shù)方案：一種快速判定含油微生物胞內(nèi)多不飽和脂肪酸含量的方法，包 括如下步驟。
[0006] (1)樣品制備；將微生物細(xì)胞菌液進(jìn)行離也，將菌體重新均勻息浮于緩沖液中，得 到細(xì)胞息浮液；W除去培養(yǎng)液中細(xì)胞之外的干擾成分。該步驟可重復(fù)若干次。
[0007] (2)核磁共振檢測(cè)；對(duì)細(xì)胞息浮液進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，得到核磁共振譜圖；所述核 磁共振檢測(cè)為iHNMR檢測(cè)或"CNMR檢測(cè)，所述核磁共振譜圖為咱譜或"C譜。
[0008] (3)結(jié)果計(jì)算和判定；所述咱譜上化學(xué)位移在1. 0-1. 3之間的峰為峰A，化學(xué)位移 在2. 5-2. 9之間峰為峰B;所述"C譜上化學(xué)位移在29. 0-30. 0之間的峰為峰A'，化學(xué)位移 在25. 0-26.0之間的峰為峰B'，所述峰A和峰A'代表飽和脂肪酸，所述峰B和峰B'代表多 不飽和脂肪酸；所述峰B和峰A峰強(qiáng)度或者峰面積的比值為R，所述峰B'和峰A'峰強(qiáng)度或 者峰面積的比值為R' ；所述R或R'越大，多不飽和脂肪酸的含量越高。
[0009] 優(yōu)選的是，所述含油微生物為W脂滴形式儲(chǔ)存油脂、且油脂含量不低于細(xì)胞干重 5%的微生物。
[0010] 優(yōu)選的是，所述含油微生物包括真菌、細(xì)菌、微藻和酵母。
[0011] 優(yōu)選的是，步驟（1)所述的緩沖液的抑和離子強(qiáng)度與菌體培養(yǎng)基相近。
[0012] 本發(fā)明的有益效果： 1)本發(fā)明利用細(xì)胞內(nèi)自身油脂含量高該一特點(diǎn)，直接使用細(xì)胞進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，樣 品制備和檢測(cè)過(guò)程極為簡(jiǎn)單，只需對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行簡(jiǎn)單置換，無(wú)需樣品干燥、油脂抽提、轉(zhuǎn)醋 化等過(guò)程，無(wú)需使用有機(jī)溶劑，節(jié)省了人力物力。
[0013] 2)本發(fā)明使用核磁共振譜圖上的特征峰進(jìn)行檢測(cè)，使用電譜或"C譜。在常規(guī)的 600MHz核磁共振譜儀上，咱譜檢測(cè)時(shí)間在十分鐘之內(nèi)可W完成，"C譜在半小時(shí)之內(nèi)可W完 成，檢測(cè)迅速便捷。
[0014] 3 )本發(fā)明由于快速便捷，適用于大量樣品的高通量檢測(cè)，如微生物大規(guī)模篩選，培 養(yǎng)條件優(yōu)化，工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程監(jiān)測(cè)等，具有重要的產(chǎn)業(yè)化意義。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為裂殖壺藻細(xì)胞的咱核磁共振譜圖。
[0016] 圖2為裂殖壺藻細(xì)胞的"C核磁共振譜圖。
[0017] 圖3為使用咱譜計(jì)算的比值R和使用"C譜計(jì)算的比值R'之間的關(guān)系。
[0018] 圖4為不同培養(yǎng)條件下裂殖壺藻使用電譜計(jì)算的DHA相對(duì)含量和使用GC測(cè)定的 DHA含量之間的關(guān)系。
[0019] 圖5為不同培養(yǎng)條件下裂殖壺藻使用"C譜計(jì)算的DHA相對(duì)含量和使用GC測(cè)定的 DHA含量之間的關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[00川 實(shí)施例1 本實(shí)施例為使用本發(fā)明方法比較一種微藻，裂殖壺藻在不同培養(yǎng)條件下的多不飽和脂 肪酸含量，具體步驟如下： 一、樣品制備：取不同培養(yǎng)條件的9個(gè)裂殖壺藻細(xì)胞樣品各1毫升在轉(zhuǎn)速為8000g的 條件下離也，去除上清液；將菌體沉淀重息于4倍于菌體體積的磯酸緩沖液中。將該菌體重 息液在轉(zhuǎn)速為8000g的條件下離也，去除上清液；將菌體沉淀重息于和菌體體積相等的磯 酸緩沖液中。樣品準(zhǔn)備過(guò)程中使用的磯酸緩沖液具有和培養(yǎng)基相同的抑和離子強(qiáng)度。
[0022] 二、核磁共振檢測(cè)；取細(xì)胞重息液500微升，添加50微升重水，放置于5毫米外徑 的核磁共振樣品管中，在600MHz的核磁共振波譜儀上測(cè)定咱譜和"C譜。咱譜實(shí)驗(yàn)采用標(biāo) 準(zhǔn)的水峰壓制的脈沖程序，"C譜使用標(biāo)準(zhǔn)的咱去禪的脈沖程序。咱譜實(shí)驗(yàn)時(shí)間為3分鐘， "C譜實(shí)驗(yàn)時(shí)間為10分鐘。對(duì)每個(gè)樣品分別得到如圖1的咱譜和圖2的"C譜。
[0023] H、結(jié)果計(jì)算；通過(guò)計(jì)算峰B和峰A的強(qiáng)度比值R或者峰B'和峰A'的強(qiáng)度比值 R'，比較各個(gè)樣品之間多不飽和脂肪酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1可知，樣品3的咱譜 的R值和"C譜的R'值均為最大，為含有多不飽和脂肪酸含量最高的樣品條件。
[0024] 四、本方法可靠性的驗(yàn)證：本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，其測(cè)量誤差主要來(lái)自樣品中可 能在觀測(cè)譜峰位置產(chǎn)生信號(hào)的雜質(zhì)，W及核磁共振實(shí)驗(yàn)自身的誤差。對(duì)我們測(cè)定的樣品的 電譜的R值和"C譜R'值進(jìn)行線(xiàn)性回歸（見(jiàn)圖3)，其R2=0. 9929,表明電譜和"C譜具有相 近的可靠性。對(duì)前面測(cè)定的9個(gè)樣品進(jìn)行油脂提取，使用GC測(cè)定每個(gè)樣品的多不飽和脂肪 酸含量。將GC測(cè)定的結(jié)果與咱譜和"C譜得到的結(jié)果進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5,其 R2為0. 8810和0. 8601，表明我們的方法和傳統(tǒng)GC方法之間具有較好的吻合度。
[00巧]表1. 9個(gè)不同培養(yǎng)條件的樣品的R和R'
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速判定含油微生物細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸含量的方法，其特征在于：包括如 下步驟： 樣品制備：將微生物細(xì)胞菌液進(jìn)行離心，將菌體重新均勻懸浮于緩沖液中，得到細(xì)胞懸 浮液； 核磁共振檢測(cè)：對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，得到核磁共振譜圖；所述核磁共振 檢測(cè)為1HNMR檢測(cè)或13CNMR檢測(cè)，所述核磁共振譜圖為1H譜或 13C譜； 結(jié)果計(jì)算：所述1H譜上化學(xué)位移在1. 0-1. 3之間的峰為峰A，化學(xué)位移在2. 5-2. 9之 間峰為峰B ;所述13C譜上化學(xué)位移在29. 0-30. 0之間的峰為峰A'，化學(xué)位移在25. 0-26. 0 之間的峰為峰B'，所述峰A和峰A'代表飽和脂肪酸，所述峰B和峰B'代表多不飽和脂肪 酸；所述峰B和峰A峰強(qiáng)度或者峰面積的比值為R，所述峰B'和峰A'峰強(qiáng)度或者峰面積的 比值為R' ；所述R或R'越大，多不飽和脂肪酸的含量越高。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速判定含油微生物細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸含量的方 法，其特征在于：所述含油微生物為以脂滴形式儲(chǔ)存油脂、且油脂含量不低于細(xì)胞干重5% 的微生物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速判定含油微生物細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸含量的方 法，其特征在于：所述含油微生物包括真菌、細(xì)菌、微藻和酵母。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種快速判定含油微生物細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂 肪酸含量的方法，其特征在于：步驟（1)所述的緩沖液的PH和離子強(qiáng)度與菌體培養(yǎng)基一致。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)含油微生物細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸含量的方法，主要是檢測(cè)微藻、細(xì)菌、真菌、酵母等微生物中細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸的相對(duì)含量，是將細(xì)胞培養(yǎng)液離心后，將菌體重懸于緩沖液中，測(cè)定核磁共振1H譜或13C譜，根據(jù)核磁共振譜圖上特征峰的強(qiáng)度比來(lái)比較不同樣品的多不飽和脂肪酸的含量。本發(fā)明和傳統(tǒng)脂肪酸含量測(cè)定方法相比，無(wú)需樣品干燥、細(xì)胞破碎、油脂提取、轉(zhuǎn)酯化等操作，無(wú)需使用有機(jī)溶劑，節(jié)約了人力物力，大大提高了測(cè)定效率，適用于大量樣品的高通量快速檢測(cè)，如微生物篩選，培養(yǎng)條件優(yōu)化，工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程監(jiān)測(cè)等。
【IPC分類(lèi)】G01N24/08
【公開(kāi)號(hào)】CN104950006
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410118153
【發(fā)明人】馮銀剛, 蘭君, 譚延振, 宋曉金, 崔球
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2014年3月27日