一種高效液相色譜測(cè)定鹽霉素中洋橄欖葉素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析測(cè)試領(lǐng)域，設(shè)及一種藥物雜質(zhì)的檢測(cè)方法，具體設(shè)及一種高效液 相色譜測(cè)定鹽霉素中洋橄攬葉素的方法。
【背景技術(shù)】
[000引鹽霉素（Salinomycin)是由白色鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的聚離類動(dòng)物專用抗生素，具 有防治動(dòng)物球蟲(chóng)病和促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育的功能，被廣泛地用于國(guó)內(nèi)外的畜牧業(yè)中。但是，在 鹽霉素產(chǎn)品中，如果發(fā)酵工藝或菌種發(fā)生變化，將會(huì)有洋橄攬葉素的伴生，當(dāng)含量超出一定 限度，將對(duì)飼養(yǎng)對(duì)象產(chǎn)生不良反應(yīng)，一定程度上會(huì)影響鹽霉素的使用效果。所W，作為一 種對(duì)產(chǎn)品有影響的雜質(zhì)，要求必須對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
[0003] 由于洋橄攬葉素在鹽霉素中的含量相對(duì)較低（一般小于0.2%)，目前還沒(méi)用一種 相對(duì)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且準(zhǔn)確可靠的方法，能夠滿足對(duì)鹽霉素中的洋橄攬葉素進(jìn)行測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種高效液相色譜測(cè)定鹽霉素中洋橄攬葉素的 方法，通過(guò)供試品與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的對(duì)比，同時(shí)利用峰面積外標(biāo)法進(jìn)行洋橄攬葉素的定 性與定量檢測(cè)。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 一種高效液相色譜測(cè)定鹽霉素中洋橄攬葉素的方法，采用如下色譜條件：
[0007] 色譜柱；（C18, 5um)色譜柱；
[000引 流動(dòng)相；W水、磯酸、己膳、甲醇的體積比360~440:9~11:450~550:81~99 為流動(dòng)相，所述磯酸濃度為2mol/L;
[0009] 流速；0. 8 ~1. 2ml/min
[0010] 檢測(cè)波長(zhǎng)；240nm~270nm
[0011] 柱溫；35 ~45°C
[001引優(yōu)選的，所述流動(dòng)相中水、磯酸、己膳、甲醇的體積比為40:1:50:9。
[001引優(yōu)選的，檢測(cè)條件中流速為1.OOml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254皿，柱溫為40°C。
[0014] 檢測(cè)方法通過(guò)W下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0015] (1)洋橄攬葉素標(biāo)品溶液配制：取洋橄攬葉素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成溶液，過(guò) 0. 22ym濾膜，備供試標(biāo)品溶液用；
[0016] (2)鹽霉素樣品溶液配制：取鹽霉素樣品用甲醇配制成溶液，過(guò)0.22ym濾膜，備 供試樣品溶液用；
[0017] (3)取相同體積的供試標(biāo)品和樣品溶液，注入高效液相色譜儀，按照權(quán)利要求1-3 中任一項(xiàng)所述的條件進(jìn)行高效液相色譜分析；
[0018] 用峰面積外標(biāo)法計(jì)算相關(guān)物質(zhì)含量：
[0019] 鹽霉素樣品溶液中洋橄攬葉素濃度=^xc梳式中為樣品中洋橄攬葉素的 As 桿 峰面積；Afi為洋橄攬葉素標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；Cfi為標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度。
[0020] 優(yōu)選的，將所述洋橄攬葉素標(biāo)品配制成10μg/ml溶液，鹽霉素樣品配制成lOmg/ ml的溶液。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于；1)色譜條件相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要梯度洗脫，也不需要衍生 反應(yīng)；樣品制備相對(duì)簡(jiǎn)單省事，不需要固相萃取，該樣可W節(jié)約成本、提高檢測(cè)效率；2)測(cè) 試準(zhǔn)確度高，樣品加標(biāo)的回收率可達(dá)到95%~98% ;3)精度高，日內(nèi)精密度，RSD小于1% ; 日間精密度，RSD小于2% ;4)有很好的線性相關(guān)性，在0. 2yg/ml~20yg/ml的濃度范圍 內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)0.99985 ;5)靈敏度高，樣品檢測(cè)的定量限可達(dá)35ppm(S/N= 10)，檢測(cè) 限可達(dá)10ppm(S/N= 2)?？蒞實(shí)現(xiàn)對(duì)含洋橄攬葉素大于lOppm的樣品直接進(jìn)行檢測(cè)，樣品 不需固相萃取、富集，使樣品的處理簡(jiǎn)單化；6)專屬性強(qiáng)，測(cè)試過(guò)程不受其它成分的干擾， 與其它成分的分離度可達(dá)2. 0W上；對(duì)洋橄攬葉素峰進(jìn)行純度測(cè)定，純度指數(shù)為正；7)耐用 性好，色譜條件的微小變化，不影響測(cè)試的準(zhǔn)確性。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行 說(shuō)明：
[0023] 圖1為洋橄攬葉素標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試圖譜；
[0024] 圖2為鹽霉素樣品測(cè)試圖譜；
[0025] 圖3為空白溶劑測(cè)試圖譜；
[0026] 圖4為洋橄攬葉素濃度與對(duì)應(yīng)峰面積的線性圖；
[0027] 圖5為洋橄攬葉素峰純度分析曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[002引下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0029] 實(shí)施例1檢測(cè)鹽霉素樣品
[0030] 試驗(yàn)儀器和條件：
[003U島津LC-20系列高效液相色譜儀，SPD-M20A檢測(cè)器；
[003引 色譜柱；PackedColumn#3056(C18, 5i0,4X250mm(日本Hitachi公司），LOT NO. 090625-2；
[0033] 柱溫；4(TC
[0034] 流動(dòng)相：水：2mol/l磯酸：己膳：甲醇=400:10:500:90(V:V)
[0035] 流速；1.00血/min
[0036] 檢測(cè)波長(zhǎng)；UV254nm
[0037] 注射體積；10
[00測(cè)采樣時(shí)間；30分鐘
[0039] 純化水她LC級(jí)），磯酸（優(yōu)級(jí)純），己膳她LC級(jí)），甲醇她LC級(jí)），洋橄攬葉素 標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Selleckchem公司提供）。
[0040] 檢測(cè)步驟；
[0041] (1)洋橄攬葉素標(biāo)品溶液的配制：自冰箱中取出洋橄攬葉素標(biāo)準(zhǔn)品，置于干燥器 中，放置到室溫后使用。準(zhǔn)確稱取洋橄攬葉素標(biāo)準(zhǔn)品5mg于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，并 稀釋至刻度，制成濃度為100yg/mL的洋橄攬葉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冰箱中2~5°C下保存7天。 精密量取洋橄攬葉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1ml于10ml容量瓶中，然后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成 濃度為10yg/mL的溶液。
[0042] (2)鹽霉素樣品溶液配制；準(zhǔn)確稱取鹽霉素樣品1.OOg，轉(zhuǎn)移到100ml的容量瓶中， 用甲醇溶解，并稀釋至刻度，于磁力攬拌器上攬拌10分鐘，所述鹽霉素樣品中洋橄攬葉素 實(shí)際濃度為5yg/mL。
[0043] (3)測(cè)定；開(kāi)啟高效液相色譜儀，按上述色譜條件設(shè)定相關(guān)參數(shù)，使儀器系統(tǒng)運(yùn)行 平衡1小時(shí)，將配制好的洋橄攬葉素標(biāo)品溶液和鹽霉素樣品溶液，經(jīng)0. 22ym的巧龍型微孔 濾膜過(guò)濾到1.5ml的樣品瓶中，蓋好瓶蓋，再用空白溶劑作為對(duì)比溶液，放入高效液相色譜 儀自動(dòng)進(jìn)樣器中，按照設(shè)定好的色譜條件，依次進(jìn)行測(cè)定，記錄標(biāo)品、樣品、對(duì)比溶液的圖譜 分別如圖1、圖2和圖3所示。
[0044] 結(jié)果分析；
[0045] 從圖1和圖3可得出洋橄攬葉素保留時(shí)間在14. 8左右，圖2在保留時(shí)間14. 8左 右也出現(xiàn)了很明顯的波峰，由此可得出圖2圖譜中有洋橄攬葉素，并可W確定樣品中的洋 橄攬葉素的保留時(shí)間位置，將圖1譜圖信息記錄至表1，通過(guò)進(jìn)一步計(jì)算得出鹽霉素樣品譜 圖信息如表2所示。
[0046] 表1 ;洋橄攬葉素標(biāo)準(zhǔn)品譜圖數(shù)據(jù)
[0047]
[0化2] W上可說(shuō)明按上述檢測(cè)方法可檢測(cè)出鹽霉素樣品中洋橄攬含量。
[0化3] 鹽霉素樣品中洋橄攬葉素實(shí)際添加濃度為5.0 y g/ml，與本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行偏差計(jì) 算；（4.738-5. 00)/5.0 = -5. 2%，小于±10%，該對(duì)于微量組分來(lái)說(shuō)，準(zhǔn)確度已是相對(duì)較 局。
[0054] 實(shí)施例2濃度線性曲線的確定
[0055] 將洋橄攬葉素標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度分別為1yg/ml、2yg/ml、4yg/ml、8yg/ml、 10yg/ml、16yg/ml、20yg/ml的溶液，按上述色譜條件設(shè)定相關(guān)參數(shù)，用高效液相色譜儀 依次進(jìn)行測(cè)定，得出每個(gè)濃度下的峰面積，并記錄數(shù)據(jù)如表3 :
[0化6] 表3洋橄攬葉素濃度與對(duì)應(yīng)峰面積測(cè)定數(shù)據(jù)
[0057]
[005引將表3數(shù)據(jù)做出線性曲線圖，如圖4所示，由圖4可看出，洋橄攬葉素在1yg/ml~ 20yg/ml的濃度范圍內(nèi)具有很好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)0. 99985,該也進(jìn)一步說(shuō) 明本發(fā)明所采用檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高。
[0059] 實(shí)施例3檢出限和定量限的確認(rèn)
[0060] 檢出限確認(rèn)；用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，洋橄攬葉素的檢出限為0. 1yg/ml(相當(dāng)于含洋 橄攬葉素lOppm的樣品），重復(fù)3次，S/N> 2 ;
[006U 定量限確認(rèn)；用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，洋橄攬葉素的定量限為0.35μg/ml(相當(dāng)于含 洋橄攬葉素35ppm的樣品），重復(fù)3次，S/N> 10 ;
[006引該說(shuō)明本檢測(cè)方法靈敏度高，樣品檢測(cè)的定量限可達(dá)35ppm(S/N= 10)，檢測(cè)限可 達(dá)10ppm(S/N= 2)，可W實(shí)現(xiàn)對(duì)含洋橄攬葉素大于lOppm的樣品直接進(jìn)行檢測(cè)，樣品不需固 相萃取、富集，使樣品的處理簡(jiǎn)單化。
[0063] 實(shí)施例4峰純度確定
[0064] 采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)樣品中洋橄攬葉素峰的純度，純度 曲線如圖5,從圖5可看出，純度指數(shù)為正，說(shuō)明測(cè)試到的洋橄攬葉素峰是純的，不受其它成 分的干擾，與其它成分的分離度可達(dá)2.0W上。
[0065] 最后說(shuō)明的是，W上優(yōu)選實(shí)施例僅用W說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W在 形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效液相色譜測(cè)定鹽霉素中洋橄欖葉素的方法，其特征在于，采用如下色譜條 件： 色譜柱：(C18,5um)色譜柱； 流動(dòng)相：以體積比為360~440:9~11:450~550:81~99的水、磷酸溶液、乙腈、甲 醇的混合溶液為流動(dòng)相，所述磷酸溶液濃度為2mol/L; 流速：〇? 8 ~1. 2ml/min; 檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm~270nm; 柱溫：35~45°C。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述流動(dòng)相中水、磷酸、乙腈、甲醇的體積 比為 40:1:50:9。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，流速為1. 00mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，柱 溫為40°C。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)： (1) 洋橄欖葉素標(biāo)品溶液配制：取洋橄欖葉素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成溶液，過(guò)0.22ym濾 膜，備供試標(biāo)品溶液用； (2) 鹽霉素樣品溶液配制：取鹽霉素樣品用甲醇配制成溶液，過(guò)0. 22ym濾膜，備供試 樣品溶液用； (3) 取相同體積的供試標(biāo)品和樣品溶液，注入高效液相色譜儀，按照權(quán)利要求1-3中任 一項(xiàng)所述的條件進(jìn)行高效液相色譜分析； 鹽霉素樣品溶液中洋橄欖葉素濃度=#xC標(biāo);式中：A#為樣品中洋橄欖葉素的峰面 積；Ag為洋橄欖葉素標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；Cg為標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，將所述洋橄欖葉素標(biāo)品配制成含洋橄欖 葉素l〇μg/ml的溶液，鹽霉素樣品配制成10mg/ml的溶液。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效液相色譜測(cè)定鹽霉素中洋橄欖葉素的方法，采用如下色譜條件：色譜柱：(C18，5um)色譜柱；流動(dòng)相：以體積比為360～440:9～11:450～550:81～99的水、磷酸、乙腈、甲醇的混合溶液為流動(dòng)相，所述磷酸濃度為2mol/L；流速：0.8～1.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm～270nm；柱溫：35～45℃；進(jìn)樣量：5～15μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器。配制洋橄欖葉素標(biāo)品溶液配制和鹽霉素樣品溶液，再按照上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，并通過(guò)峰面積計(jì)算出鹽霉素中洋橄欖葉素的含量。本檢測(cè)方法色譜條件相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要梯度洗脫，也不需要衍生反應(yīng)，樣品制備相對(duì)簡(jiǎn)單省事，不需要固相萃取，這樣可以節(jié)約成本、提高檢測(cè)效率，并且測(cè)試準(zhǔn)確度高，樣品加標(biāo)的回收率可達(dá)到95％～98％。
【IPC分類】G01N30/02, G01N30/06
【公開(kāi)號(hào)】CN104950054
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510431874
【發(fā)明人】謝昌賢, 秦定宇, 劉運(yùn)添, 云喜報(bào), 金玲玲, 楊曉亞, 張?jiān)夯? 王鵬飛
【申請(qǐng)人】金河生物科技股份有限公司
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年7月21日