己酰甘氨酸作為增重和肥胖傾向的生物標(biāo)志物的制作方法
【專利說明】己酰甘氨酸作為增重和肥胖傾向的生物標(biāo)志物
[0001]本發(fā)明一般地涉及營養(yǎng)和健康領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及新生物標(biāo)志物、其用途和允許其診斷抵抗飲食誘導(dǎo)的增重，和/或易受飲食誘導(dǎo)的增重的可能性的方法。例如，生物標(biāo)志物可以是己酰甘氨酸。此生物標(biāo)志物也可用于診斷/監(jiān)測生活方式改變對對象中增重風(fēng)險的影響。
[0002]肥胖已經(jīng)成為21世紀(jì)中最重要的全球性健康問題，因為其升高了患其他疾病，包括2型糖尿病、肝性脂肪變性(NAFLD)、癌癥、關(guān)節(jié)炎和心血管疾病(CVD)的風(fēng)險。肥胖的病因?qū)W來自遺傳和環(huán)境因素諸如高熱量飲食、缺乏體力活動和行為的復(fù)雜相互作用。參與多種生理功能諸如腸道先天免疫系統(tǒng)的成熟和養(yǎng)分的消化/吸收的腸道微生物群也影響了若干種代謝疾病的發(fā)展并且似乎對肥胖具有顯著的影響。因此，發(fā)生肥胖的個體傾向根據(jù)這些多因素原因而不同。
[0003]攝入富含脂肪和/或碳水化合物的不平衡飲食已經(jīng)與脂肪組織以及瘦組織諸如肝、肌肉和心臟中的增加的甘油三酯貯藏速率相關(guān)聯(lián)。此異位脂肪沉積誘導(dǎo)性脂毒性也與多種代謝病癥諸如高甘油三酯血癥、高血壓、高空腹血糖和胰島素抵抗(IR)相關(guān)聯(lián)。然而，一些超重或肥胖人可能發(fā)展出多種代謝病癥而其他人保持健康。例如，身體中脂肪沉積的定位影響代謝病癥的發(fā)展。已經(jīng)將足以釋放致動脈粥樣硬化的脂連蛋白并處理脂肪酸的心外膜脂肪明確地與人中CVD標(biāo)志物相關(guān)聯(lián)。相比較之下，已經(jīng)將肝內(nèi)脂肪與炎癥和胰島素抵抗相關(guān)聯(lián)。Wildman等人也突出了健康中年女性中的種族與族群差異與內(nèi)臟和皮下脂肪組織的差別的代謝活性相關(guān)聯(lián)，這能影響發(fā)展出肥胖和CVD的族群相關(guān)的傾向。因此，在早期階段鑒定出發(fā)展肥胖相關(guān)的代謝病癥的可能性，以評價個體代謝狀態(tài)和有效地預(yù)防代謝疾病的發(fā)展是相關(guān)的。
[0004]因此為本領(lǐng)域提供允許早期-理想地在其增重之前-鑒定當(dāng)消耗富含脂肪的飲食時很可能增重的對象的方法將是合乎期望的。
[0005]本說明書中對現(xiàn)有技術(shù)文件的任何參考不應(yīng)被認(rèn)為是承認(rèn)此類現(xiàn)有技術(shù)是廣泛已知的或形成本領(lǐng)域中普通一般知識的一部分。
[0006]本發(fā)明的目的是提高本領(lǐng)域技術(shù)并且特別地是提供允許在早期有效地將人們分層為其是否很可能響應(yīng)高脂肪飲食而增重的方法。
[0007]本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的目的能夠通過獨立權(quán)利要求的主題實現(xiàn)。從屬權(quán)利要求進(jìn)一步發(fā)展了本發(fā)明的觀點。
[0008]因此，本發(fā)明提供了生物標(biāo)志物，其用途和診斷抵抗高脂肪飲食誘導(dǎo)的增重的可能性的方法。
[0009]如本說明書中所用，詞語“包含”，“含有”，和相似的詞語不應(yīng)以排他性或窮盡性含義解釋。換言之，其旨在意為“包括，但不限于”。
[0010]本發(fā)明人已經(jīng)使用了代謝組學(xué)方法以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。代謝組學(xué)在今天被認(rèn)為是表征代謝表型的完善建立的系統(tǒng)方法，其包含多種因素諸如環(huán)境、藥物、飲食、生活方式、遺傳學(xué)，和微生物組因素的影響。與提示生理學(xué)變化的可能性的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)不同，代謝物及其在細(xì)胞、組織和器官內(nèi)的動態(tài)濃度改變，代表了生理調(diào)控過程的真正終點。
[0011]因此，研宄與多種飲食性干預(yù)和疾病發(fā)展關(guān)聯(lián)的逐漸的代謝改變是合適的方法。最近，基于代謝組學(xué)和脂類組學(xué)的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)加速了我們對疾病過程的理解，并且將提供用于與代謝綜合征相關(guān)聯(lián)的亞臨床病癥的預(yù)防和營養(yǎng)管理的新途徑?！敖M學(xué)”數(shù)據(jù)已經(jīng)突出了能量代謝(Krebs循環(huán))、脂類和氨基酸加工，以及炎性信號對肥胖和IR發(fā)作的貢獻(xiàn)。
[0012]使用隨時間收集的尿樣品的質(zhì)子核磁共振(1H NMR)光譜學(xué)和增重監(jiān)控的組合，本發(fā)明人已經(jīng)在良好定義的C57BL/6J小鼠模型中鑒定了由高脂肪飲食誘導(dǎo)的逐漸增重的新的代謝生物標(biāo)志物。公知此動物模型在同基因動物中顯示極端表型，即抵抗或傾向于高脂肪誘導(dǎo)的增重分布的動物。本發(fā)明人已經(jīng)表征了用高脂肪飲食(HFD)飼喂的C57BL/6小鼠的短期(7天)和長期(60天)代謝適應(yīng)并且已經(jīng)建立了與HFD飼喂的小鼠(即抵抗或傾向于高脂肪誘導(dǎo)的增重的動物)中的表型變異性相關(guān)聯(lián)的具體代謝標(biāo)志。通過使用代謝組學(xué)方法，發(fā)明人已經(jīng)顯示線粒體代謝途徑(脂肪酸β氧化、支鏈氨基酸分解代謝、丁酸代謝、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸途徑和Krebs循環(huán))由高脂肪飼喂快速上調(diào)，這可能反映線粒體的脂肪酸飽和以及能量代謝的損害。
[0013]發(fā)明人能夠顯示在HFD下肥胖抗性的小鼠與線粒體氧化途徑(β氧化、丁酸代謝和亮氨酸分解代謝)的具體激活相關(guān)聯(lián)，所述激活可能是針對脂肪酸過載的保護(hù)性機(jī)制。
[0014]這些結(jié)果強調(diào)了線粒體在肥胖發(fā)展中的作用并允許得出這樣的結(jié)論，S卩，使用發(fā)明人已經(jīng)鑒定的具體的生物標(biāo)志物組，能夠從早期代謝標(biāo)志測定發(fā)展代謝病癥，諸如肥胖的可能性。
[0015]發(fā)明人能夠顯示在高脂肪飼喂一周后(第7天)的尿代謝響應(yīng)使得不僅能預(yù)測每個個體的最終增重(第60天)，還能夠根據(jù)其抵抗或傾向于高脂肪誘導(dǎo)的增重的傾向而對動物分層。
[0016]因此，本發(fā)明涉及新的生物標(biāo)志物己酰甘氨酸。
[0017]本發(fā)明還涉及己酰甘氨酸作為尿中用于檢測和/或定量抵抗高脂肪飲食誘導(dǎo)的增重的可能性的生物標(biāo)志物的用途。相似地，本發(fā)明還涉及己酰甘氨酸作為尿中用于檢測和/或定量易受高脂肪飲食誘導(dǎo)的增重的可能性的生物標(biāo)志物的用途。
[0018]本發(fā)明還涉及診斷受試者中抵抗高脂肪飲食誘導(dǎo)的增重的可能性的方法，所述方法包括測定先前從待測試的受試者獲得的尿樣品中己酰甘氨酸的水平，和比較受試者的己酰甘氨酸水平與預(yù)測定的參照值，其中預(yù)測定的參照值是基于對照群體中尿中的平均己酰甘氨酸水平，并且其中較之預(yù)測定的參照值樣品中增加的己酰甘氨酸水平表明抵抗高脂肪飲食誘導(dǎo)的增重的增加的可能性。相似地，本發(fā)明也涉及診斷受試者中易受高脂肪飲食誘導(dǎo)的增重的可能性的方法，所述方法包括測定先前從待測試的受試者獲得尿樣品中己酰甘氨酸的水平，并比較受試者的己酰甘氨酸水平與預(yù)測定的參照值，其中預(yù)測定的參照值是基于對照群體中尿中的平均己酰甘氨酸水平，并且其中較之預(yù)測定的參照值樣品中降低的己酰甘氨酸水平或沒有改變提示易受高脂肪飲食誘導(dǎo)的增重的增加的可能性。
[0019]本發(fā)明的此生物標(biāo)志物也可用于診斷和/或監(jiān)測生活方式的改變對受試者中增重風(fēng)險的影響。對于此，可以在生活方式改變之前測定生物標(biāo)志物水平并且在生活方式改變之后將獲得的水平可以與所述生物標(biāo)志物的水平比較。
[0020]圖1:在飼喂HFD的η = 56只小鼠的群體中身體增重的變異性。(A)實驗設(shè)計。(B) 7天和60天HFD飼喂后小鼠的體重分布。(C)在每個時間點鑒定對肥胖非響應(yīng)者(NR)和強響應(yīng)者(SR)小鼠。在2個時間點或在實驗的整個過程中觀察若干NR和SR小鼠。(D)在飲食前(t0)、HFD飼養(yǎng)的7天后(tl)和60天后(t2)，對照(n = 24) ,NR(η = 30)，和SR (η = 29)小鼠的體重監(jiān)控。s (η =平均土標(biāo)準(zhǔn)誤，非參數(shù)Mann和Whitney檢驗的ρ值*<0.05, **<0.001, ***〈0.0001.)
[0021]圖2:飲食轉(zhuǎn)換后7天和60天，C57BL/6HFD飼喂的或LFD飼喂的小鼠的1H NMR尿代謝譜。㈧來自LH)飼喂的小鼠或⑶ΗΠ)飼喂的小鼠的尿的平均1H NMR光譜。(C)7天時LFD和HFD飼喂的小鼠的尿代謝譜的OPLS-DA分?jǐn)?shù)圖。(D) 60天時LFD和HFD飼喂的小鼠的尿代謝譜的OPLS-DA分?jǐn)?shù)圖。(E)從OPLS-DA系數(shù)圖獲得的熱點圖顯示發(fā)現(xiàn)在HFD和LFD飼喂的小鼠中顯著不同的代謝物。通過顏色代碼展示代謝物的相關(guān)值。(紅色梯度:與HFD飼喂的小鼠正相關(guān)的代謝物和藍(lán)色梯度:負(fù)相關(guān)的代謝物)。
[0022]圖3:NR和SR小鼠的具體代謝標(biāo)志。(A)來自NR小鼠或⑶SR小鼠的尿的1H NMR光譜平均值。(C) 7天時和(D) 60天時NR和SR小鼠的尿代謝譜的OPLS-DA分?jǐn)?shù)圖。(E)從OPLS-DA系數(shù)圖獲得的熱點圖顯示發(fā)現(xiàn)在NR和SR小鼠中顯著不同的代謝物。通過顏色代碼展示代謝物的相關(guān)值。(紅色梯度:與SR小鼠正相關(guān)的代謝物和藍(lán)色梯度:負(fù)相關(guān)的代謝物)。
[0023]圖4:BCAA、丁酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸代謝、Krebs循環(huán)和β氧化中涉及的代謝物的尿排泄型的作圖。條狀圖顯示代謝物的帶有標(biāo)準(zhǔn)誤的平均比率在第7天至第O天或第60天至第O天的積分。Y軸提示LF、HF、NR和SR小鼠的平均值(任意單位)。LF和HF或NR和SR的平均比率之間的顯著差異使用非參數(shù)Mann Whitney檢驗計算:*〈0.05，**〈0.001, ***〈0.0001 (平均值，標(biāo)準(zhǔn)誤和ρ值在補充表3和4中)。用虛線箭頭突出間接代謝反應(yīng)。
[0024]圖5顯示在預(yù)測NR和SR中代謝物重要性和穩(wěn)健性，如通過隨機(jī)森林分析所評估的。
[0025]表1:在高脂肪誘導(dǎo)的增重中代謝物和增重之間的關(guān)系的總結(jié)
[0026]表2:在抵抗增重(NR)和傾向增重(SR)個體中選擇的代謝物隨時間的變化倍數(shù)的總結(jié)
[0027]本發(fā)明部分地涉及生物標(biāo)志物，其中生物標(biāo)志物是己酰甘氨酸。
[0028]在本文描述的實驗中，用HFD飼喂的小鼠展示出尿中己酰甘氨酸隨時間增加。不希望被任何理論束縛，發(fā)明人目前認(rèn)為己酰甘氨酸在體內(nèi)獲自肝中己酰-CoA與甘氨酸的結(jié)合并然后在尿中分泌。己酰-CoA是氧化的中間代謝物并且肉堿負(fù)責(zé)線粒體中脂肪酸的攝取，這是β氧化過程中的關(guān)鍵起始步驟。這些結(jié)果因此提示通過β氧化的脂肪酸分解的上調(diào)并且強調(diào)了線粒體中氧化性燃料的飽和，這可能改變能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)。HFD小鼠的尿中若干Krebs循環(huán)中間物和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸途