一種基于四面體嵌銀結(jié)構(gòu)的超靈敏檢測血管內(nèi)皮生長因子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種基于四面體嵌銀結(jié)構(gòu)的超靈敏檢測血管內(nèi)皮生長因子的方法，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一類糖蛋白，以同源二聚體的形式存在，具有強(qiáng)烈的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，促進(jìn)新血管的形成。而腫瘤組織的生長，必須依靠新生血管生成來提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)來維持，因此，VEGF已被認(rèn)為是腫瘤標(biāo)志物。對腫瘤標(biāo)志物的檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)癌癥，實現(xiàn)早期治療的目的。
[0003]傳統(tǒng)的VEGF檢測方法主要為酶聯(lián)免疫法等，對單克隆抗體的要求較高，而且單克隆抗體的篩選是一項繁重且高耗的任務(wù)。本發(fā)明提出了一種新型的、簡便的、靈敏的檢測方法，其基于納米材料自組裝技術(shù)構(gòu)建了具有表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)的納米結(jié)構(gòu)，并以此作為檢測基底，通過單鏈DNA之間的互補(bǔ)雜交，將包裹有信標(biāo)分子的銀納米粒子嵌入金納米粒子四面體結(jié)構(gòu)上，利用粒子之間的電場增強(qiáng)效應(yīng)，獲得強(qiáng)的拉曼散射信號。銀納米粒子上適配體因與目標(biāo)物VEGF親和力強(qiáng)從而從四面體骨架上解離下來，造成拉曼信號下降，據(jù)此得拉曼信號強(qiáng)度與目標(biāo)物VEGF濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實現(xiàn)VEGF濃度的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于四面體嵌銀結(jié)構(gòu)的超靈敏檢測血管內(nèi)皮生長因子的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種基于嵌銀四面體結(jié)構(gòu)的超靈敏檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的方法，是基于四面體嵌銀結(jié)構(gòu)拉曼信號強(qiáng)度改變對目標(biāo)VEGF濃度進(jìn)行檢測的方法，包括金納米粒子的合成、金納米粒子修飾單鏈DNA、嵌銀四面體的組裝以及VEGF傳感器的構(gòu)建，具體如下:
一、嵌銀四面體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建:
(I)10 nm粒徑的金納米粒子的合成:
1nm粒徑的金納米粒子采用鞣酸還原法合成，反應(yīng)用的錐形瓶提前用新配置的王水浸泡24h，用超純水沖洗至潔凈，烘干待用。錐形瓶中加入79mL超純水和ImL質(zhì)量濃度1%氯金酸作為A液；另取一潔凈的小瓶子，加入4mL質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉，0.1mL質(zhì)量濃度1%單寧酸，0.1mL 25mM碳酸鉀，15.8 mL超純水作為B液;A、B液均加熱到60°C，然后在高速攪拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60°C下繼續(xù)攪拌30min到形成深紅色溶液。然后將溶液加熱回流2 min形成亮紅色溶液。最后冷卻到室溫形成檸檬酸穩(wěn)定的金納米粒子，透射電鏡顯示平均粒徑為10nm。
[0006](2)6 nm粒徑的銀納米粒子的合成:
在聚乙烯吡咯烷酮的保護(hù)下采用硼氫化鈉還原硝酸銀的方法合成粒徑為6 nm的銀納米粒子；錐形瓶的處理同上。錐形瓶中加入超純水20mL、l% PVP 5mL、0.1M硼氫化鈉(新配)0.6mL，冰浴攪拌狀態(tài)下以30mL/h的速度泵入5mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP，5mL IM的硝酸銀溶液。反應(yīng)后的溶液80°C水浴3h，以排除多余的硼氫化鈉，冷卻后放4°C冰箱待用。
[0007](3 )金納米粒子修飾DNA:
所得金納米粒子溶液中加入二水合雙(對-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液，使其終濃度為0.01mg/mL，室溫震蕩反應(yīng)包裹12h后，13000rpm離心濃縮十倍，以10 mM pH 7.4的Tris-HCl緩沖液重懸，溶液四等分，編號依次為Aul，Au2，Au 3，Au 4。
[0008]分別對應(yīng)加入5’端巰基修飾的單鏈DNA序列1，2，3，4 (DNA1，DNA2，DNA3，DNA4)，使其終濃度均為5nM。室溫孵育2h后每隔Ih加入NaCl溶液，至金納米粒子溶液中鹽粒子濃度為300 mM為止。溶液室溫老化24h后離心除去未結(jié)合的單鏈DNA，10 mM Tris-HCl重懸待用。
[0009]DNAl:
5’ -SH-TTTGCCTGGA GATACATGCA CATTACGGCT TTCCCTATTA GAAGGTCTCA GGTGCGCGTTTCGGTAAGTA GACG-3’ ；
DNA2:
5’ -SH-TTTCGCGCAC CTGAGACCTT CTAATAGGGT TTCAGTCCACCCCCACAAAC TAGAATGCCC TTTGGGCTGT TCCGGG-3’ ；
DNA 3:
5’ -SH-TTTGGCCGAG GACTCCTGCT CCGCTGCGGT TTCAGTCCACCCCCACACGT CTACTTACCG TTTCAGTCCA CCCCCACACC CGGAACAGCC C-3’ ；
DNA 4:
5’ -SH-TTTGCCGTAA TGTGCATGTA TCTCCAGGCT TTCCGCAGCGGAGCAGGAGT CCTCGGCCTT TGGGCATTCT AGTT-3’ ；
四段單鏈DNA中含有與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的適配體部分互補(bǔ)的DNA序列，以用來與目標(biāo)物VEGF產(chǎn)生競爭，為本發(fā)明標(biāo)定VEGF濃度之用。
[0010](4)銀納米粒子的修飾適配體Apt-VEGF和信標(biāo)分子4-NTP
將所得銀納米粒子離心濃縮10倍后重懸于1mM Tris-HCl中，加入5’端修飾有巰基的VEGF適配體序列Apt-VEGF，使其終濃度為5nM，室溫孵育過夜，離心除去未結(jié)合的適配體序列，以1mM Tris-HCl緩沖液重懸，加入信標(biāo)分子4-NTP溶液，使信標(biāo)分子4-NTP溶液終濃度為4 μ M。離心去除多余的信標(biāo)分子，以10 mM Tris-HCl緩沖液重懸待用。
[0011]Apt-VEGF:5’ -SH-TTTTTTTGTG GGGGTGGACT GGGTGGGTAC C-3’ ；
(5)嵌銀四面體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建
將步驟(3)所得四組 Aux-DNAx溶液，以 Au rDNA^ Au 2-DNA2,以 Au3-DNAg Au 4_0應(yīng)4兩兩等體積混合，使其過夜雜交形成二聚組裝體，將所得二聚體等體積組裝混合，24h后得金納米粒子四面體結(jié)構(gòu)。以金納米粒子四面體結(jié)構(gòu)為單位，按四面體:銀納米粒子為1: 3的摩爾比例加入修飾有VEGF適配體Apt-VEGF的銀納米粒子，室溫24h雜交后得嵌銀四面體結(jié)構(gòu)。
[0012]二、表面增強(qiáng)拉曼信號檢測，建立嵌銀四面體結(jié)構(gòu)的拉曼信號與目標(biāo)物VEGF濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線: 向上述步驟(5)所制得的嵌銀四面體結(jié)構(gòu)中分別加入VEGF標(biāo)準(zhǔn)品，使得VEGF終濃度分別為 O fM，0.0l fM，0.05 fM，0.1 fM，0.5 fM，I fM。室溫孵育 8h 后，以 1333CHT1 處建立拉曼信號強(qiáng)度變化與VEGF濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了一種基于嵌銀四面體結(jié)構(gòu)超靈敏檢測血管內(nèi)皮生長因子VEGF的方法，與傳統(tǒng)的檢測手段相比，具有靈敏度高，檢測限低，方便，快捷優(yōu)點，有著非常好的實際應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014]圖1本發(fā)明通過核酸雜交形成的嵌銀四面體組裝體的透射電鏡照片。
[0015]圖2本發(fā)明中不同VEGF濃度下導(dǎo)致的SERS信號變化圖。
[0016]圖3本發(fā)明中SERS信號檢測VEGF的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
(一)檢測傳感器的構(gòu)建
(I)1nm粒徑的金納米粒子的合成
1nm粒徑的金納米粒子采用鞣酸還原法合成，反應(yīng)用的錐形瓶提前用新配置的王水浸泡24小時，用超純水沖洗至潔凈，烘干待用。錐形瓶中加入79mL超純水和ImL質(zhì)量濃度1%氯金酸作為A液；另取一潔凈的小瓶子，加入4 mL質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉，0.1mL質(zhì)量濃度1%單寧酸，0.1mL 25mM碳酸鉀，15.8mL超純水作為B液。A、B液均加熱到60°C，然后在高速攪拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60°C下繼續(xù)攪拌30分鐘到形成深紅色溶液。然后將溶液加熱回流2分鐘形成亮紅色溶液。最后冷卻到室溫形成檸檬酸穩(wěn)定的金納米粒子，透射電鏡顯示平均粒徑為10nm。所得溶液中加入二水合雙(對-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液，使其終濃度為0.0lmg/mL,室溫震蕩反應(yīng)12小時，13000rpm,離心去除上清，十倍濃縮于1mM pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中待用。
[0018](2) 6nm粒徑的銀納米粒子的合成
錐形瓶的處理同上。錐形瓶中加入超純水20mL、l% PVP 5mL、0.1 M硼