一種檢測瘋草提取物和膠囊中苦馬豆素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種檢測瘋草提取物和膠囊中苦馬豆素含量 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘋草（Locoweed)是豆科棘豆屬（Oxytropis)和黃巧屬（Astragalas)有毒植物的 總稱，是我國和美國西部分布最廣的有毒植物之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國現(xiàn)有瘋草44種（其 中紫云英屬21種，棘豆屬23種），構(gòu)成嚴(yán)重危害的有15種（其中紫云英屬6種，棘豆屬9 種），主要分布于陜西、甘肅、青海、西藏、新疆、內(nèi)蒙古、山西、寧夏、四川等省區(qū)。瘋草危害食 草動(dòng)物的安全，家畜采食瘋草后，可導(dǎo)致瘋草中毒綜合癥。
[0003] 苦馬豆素（swainsonine，SW)是引起瘋草中毒的主要毒性成分，1979年澳大利亞 學(xué)者Colegate首先從灰苦馬豆（Swainsonacanecens)中分離到SW。隨著研究的深入和擴(kuò) 展，人們發(fā)現(xiàn)苦馬豆素可作為免疫調(diào)節(jié)劑、腫瘤轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散抑制劑、抗病毒和細(xì)胞保護(hù)劑等 藥物使用，苦馬豆素還可W促進(jìn)骨髓增殖，能有效遞轉(zhuǎn)致死性福照或高劑量化療所造成的 骨髓抑制及隨后發(fā)生的嗜中性白細(xì)胞減少癥，并初步證明苦馬豆素對(duì)人的惡性腫瘤有治療 作用。傳統(tǒng)抗癌藥在發(fā)揮藥效的同時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體造成免疫損傷，但SW卻能刺激機(jī)體骨髓細(xì)胞 增殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，因此具有更廣闊的醫(yī)用前景，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。
[0004] 2006年，第四軍醫(yī)大學(xué)天然藥物研究所與楊凌天力生物科技有限公司合作，憑借 雄厚的科技力量和尖端的科研設(shè)備開發(fā)完成了苦馬豆素抗癌新藥的臨床前藥學(xué)、藥理研究 和抗福射試驗(yàn)，對(duì)苦馬豆素藥物活性進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究，最后成功研制成醫(yī)院制劑"棘 豆扶正膠囊"，并獲得解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)制劑批號(hào)；蘭制字（2006)F68104。棘豆扶正膠 囊是一新型抗腫瘤中藥，主要成分為棘豆中的有效單體一苦馬豆素，用于抗癌、抑制腫瘤生 長，在第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床應(yīng)用多年來收到較好的治療效果。
[0005] 目前，瘋草提取物中苦馬豆素的檢測方法有薄層色譜法（TLC)、氣相色譜法（GC) 和高效液相色譜法（HPLC)。薄層色譜法檢測方法簡單快捷，易于操作，但是用作定量檢測時(shí) 誤差卻較大，不適用于精確測量。氣相色譜法檢測限低，定量準(zhǔn)確，但在檢測時(shí)，需制備易升 華且穩(wěn)定的苦馬豆素衍生物，增加了樣品處理的難度，也增加了檢測結(jié)果的不確定度。高效 液相色譜法由于苦馬豆素水溶性很強(qiáng)，且缺乏適合分光光度法檢測的發(fā)色基團(tuán)，所W檢測 限偏高，不適用于藥物分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確 的檢測瘋草提取物和膠囊中苦馬豆素含量的方法。
[0007] 實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是；一種檢測瘋草提取物和膠囊中苦馬豆素含量的 方法包括下列步驟：
[000引 1)采用體積比1%的甲酸甲醇溶液浸泡提取出瘋草提取物或膠囊中的苦馬豆素。
[0009] 2)采用石墨化碳固相萃取柱和針式過濾器凈化處理提取液；
[0010] 3)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分離檢測苦馬豆素；
[0011] 4)W不同濃度苦馬豆素與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)峰面積作圖，得到苦馬豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將 待測樣品峰面積對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其苦馬豆素含量。
[0012] 本發(fā)明所述的甲酸甲醇溶液浸泡提取出的瘋草提取物或膠囊中的苦馬豆素，具體 步驟是：
[001引1)瘋草提取物樣品：精密稱取0.001~0.050g的瘋草提取物樣品加入10~100血 1%甲酸甲醇溶液溶解，振搖超聲后，視樣液中苦馬豆素濃度用甲醇稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍， 過0. 22um有機(jī)系針式過濾器凈化，上機(jī)測定。
[0014] 2)膠囊樣品；將膠囊內(nèi)容物混勻，準(zhǔn)確稱取0. 10~2.OOg內(nèi)容物加入10~100血 1 %甲酸甲醇溶液，振搖超聲后離屯、，400化'mirTi，lOmin。取上清液用石墨化碳固相萃取柱 和針式過濾器凈化處理。
[0015] 本發(fā)明所述的采用石墨化碳固相萃取柱和針式過濾器凈化處理提取液，具體步驟 是：
[0016] 石墨化碳固相萃取柱在使用前依次用5~15mL水、1%甲酸甲醇溶液活化。取提取 樣液加入已活化的石墨化碳固相萃取柱，棄去前1~2mU收集隨后濾液1~2mU過0. 22um 有機(jī)系針式過濾器凈化后上機(jī)測定。
[0017] 本發(fā)明采用色譜柱是C18液相色譜柱。
[001引本發(fā)明所采用的化學(xué)試劑均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水滿足GB/T6682-2008中實(shí)驗(yàn)室用 水一級(jí)水要求。
[0019] 本發(fā)明所采用的液相色譜條件為：
[0020] 進(jìn)樣量5~20uL;柱溫30~40°C;流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。
[0021] 表1流動(dòng)相梯度程序
[0022]
[0024] 本發(fā)明所采用的質(zhì)譜條件為：
[002引離子源；ESr;檢測方式；MRM;電噴霧電壓；4. 0~6.化V;氣簾氣流量；5~ 20L?h4;噴霧氣流量；40~80L?trS輔助加熱氣流量；40~80L?trS離子化電壓；25~ 50v;離子源溫度；500~600°C;碰撞氣流量；1. 0~10. 0血?min-i;碰撞能量；20~50ev; 定量離子對(duì)；174/156 ;定性離子對(duì)；174/138。
[0026] 經(jīng)HPLC-MS分析，苦馬豆素在色譜上的保留時(shí)間為1. 0~2.Omin。
[0027] 采用本發(fā)明測定瘋草提取物及膠囊中苦馬豆素的含量，線性范圍0.5~ 50. 0yg. [1，相關(guān)系數(shù)r= 0. 9994,最低定量限（LOQ) = 0.lug? [1，峰面積的重現(xiàn)性 巧SDs，n= 10) = 2. 61%，保留時(shí)間的重現(xiàn)性巧SDt，n= 10) = 0. 61%。加標(biāo)回收率 92. 40~96. 61 %。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-M巧由于其超高靈敏度，可避免絕大部分 的基質(zhì)干擾，相比于其他檢測方法前處理過程更加方便快捷，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該方法靈 敏度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，分析方法可靠。
【附圖說明】
[002引圖1是苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0029] 圖2是瘋草提取物樣品色譜圖，圖3是膠囊樣品色譜圖。