一種過敏原陽性血清的純化制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種過敏原陽性血清的純化制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 過敏是一種機(jī)體的變態(tài)反應(yīng)，是人對(duì)正常物質(zhì)（過敏原）的一種不正常的反應(yīng)，當(dāng) 過敏原接觸到過敏體質(zhì)的人群才會(huì)發(fā)生過敏，過敏原有花粉、粉塵、異體蛋白、化學(xué)物質(zhì)、紫 外線等幾百種。在過敏反應(yīng)的發(fā)生過程中，過敏介質(zhì)起著直接的作用，過敏原是過敏病癥 發(fā)生的外因，而機(jī)體免疫能力低下，大量自由基對(duì)服大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞的氧化破壞是過 敏發(fā)生的內(nèi)因。一般來講，當(dāng)過敏原第一次進(jìn)入機(jī)體時(shí)，與服大細(xì)胞或者是嗜堿性粒細(xì)胞 結(jié)合，產(chǎn)生白H帰，前列腺素等等的過敏因子，但并不會(huì)立即產(chǎn)生過敏，此特性有些將維持 2~3天，有的數(shù)月。當(dāng)機(jī)體第二次接受該種過敏原時(shí)，服大細(xì)胞才會(huì)變形，產(chǎn)生過敏因子， 也就產(chǎn)生了一系列的過敏現(xiàn)象。
[0003] 過敏可W是體液（抗體）或者是細(xì)胞免疫機(jī)制介導(dǎo)的。在大多數(shù)情況下，可產(chǎn)生 過敏反應(yīng)的抗體屬于I班類，該些個(gè)體可W歸類于患有I班介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。然而，并非所 有的特異反應(yīng)性個(gè)體都會(huì)發(fā)生與I班相關(guān)的過敏反應(yīng)；在非I班介導(dǎo)的過敏反應(yīng)中，抗體也 可W屬于IgG類，例如：包含右旋糖巧的免疫復(fù)合物導(dǎo)致的過敏性休克和和現(xiàn)在罕見的血 清病，它們W前被歸于III型過敏反應(yīng)。在患有過敏性支氣管肺曲霉菌病（ABPA)病人中， I班和IgG抗體都可W被檢出。接觸性過敏性皮炎是W淋己細(xì)胞為介導(dǎo)的過敏性疾病的代 表。I班檢測(cè)仍是公認(rèn)的過敏檢測(cè)的主流產(chǎn)品，由于點(diǎn)刺注冊(cè)問題和體外檢測(cè)技術(shù)的提高， 體外檢測(cè)今后將是過敏檢測(cè)主流趨勢(shì)；但是目前I班檢測(cè)學(xué)術(shù)進(jìn)展遲緩，基本沒有新的發(fā) 展，因此提高檢測(cè)質(zhì)量和降低檢測(cè)成本是主要開發(fā)方向。
[0004] 但是，由于過敏診斷試劑的發(fā)展緩慢W及前期人們的重視度有限，除了部分過敏 原可W購買到商業(yè)血清，大部分過敏原的陽性血清還是很難查詢到的，臨床收集少量可行， 大量或者高濃度的血清基本不能收集到，甚至于很多項(xiàng)目很少有合適的陽性血清（如；牛 肉、羊肉）。
[000引如公布號(hào)為CN103018436A，公布日為2013-4-3的一種用家兔制備雞傳染性支氣 管炎陽性血清的方法，其在經(jīng)過免疫取血后，僅將血液分離出血清，對(duì)血清進(jìn)行離也過濾就 得到陽性血清。但是，該陽性血清存在使用效果不好的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種使用效果優(yōu)良的過敏原陽性血清的純化 制備方法。
[0007] 為解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：
[0008] -種過敏原陽性血清的純化制備方法，包括用過敏原對(duì)健康動(dòng)物進(jìn)行免疫、采血 后獲得抗血清的步驟和對(duì)所述的抗血清進(jìn)行純化獲得陽性血清的步驟，所述的純化的具體 方法為：
[0009] 對(duì)所述的抗血清進(jìn)行親和純化得到IgG抗體；將所述的IgG抗體和人I班化按質(zhì) 量比為1:1~2偶聯(lián)后，經(jīng)分離純化獲得IgG-I班化連接物濃溶液，將所述的IgG-I班Fc 連接物濃溶液稀釋至濃度為0. 5~1yg/ml，即得所述的陽性血清。
[0010] 優(yōu)選地，采用瓊脂糖親和介質(zhì)或者采用免疫親和層析柱進(jìn)行所述的親和純化。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的瓊脂糖親和介質(zhì)為Protein-Ase地arose化-4B。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的免疫親和層析柱為所述的過敏原與瓊脂糖凝膠連接成的親 和層析柱。
[0013] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的抗血清先經(jīng)過硫酸饋處理后，再采用所述的免疫親和層析 柱進(jìn)行所述的親和純化。
[0014] 優(yōu)選地，所述的人I班化是將人源I班溶解木瓜蛋白酶消化液中，再用木瓜蛋白 酶消化，再用楓己醜胺終止消化反應(yīng)后，用瓊脂糖親和介質(zhì)提取獲得的。
[0015] 優(yōu)選地，所述的IgG抗體和所述的人I班化通過2-亞胺四氨喔吩偶聯(lián)劑或 4-(N-馬來醜亞胺基甲基）環(huán)己焼-1-駿酸玻巧醜亞胺醋偶聯(lián)劑活化后，在抑7. 2~7. 4 的條件下進(jìn)行所述的偶聯(lián)。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的2-亞胺四氨喔吩偶聯(lián)劑的濃度為9~llmg/ml，所述的 4-(N-馬來醜亞胺基甲基）環(huán)己焼-1-駿酸玻巧醜亞胺醋偶聯(lián)劑的濃度為4~6mg/ml。
[0017] 優(yōu)選地，采用Se地adex200凝膠純化柱進(jìn)行所述的分離純化。
[001引優(yōu)選地，采用含質(zhì)量比為0.4~0.6%的牛血清白蛋白、抑7. 5~8. 5、0. 09~ 0.llmol/L的H輕甲基氨基甲焼緩沖液將所述的IgG-I班化連接物濃溶液進(jìn)行所述的稀 釋。
[0019] 由于W上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] 我們可W根據(jù)市場(chǎng)需要來有計(jì)劃的生產(chǎn)（從幾毫升到幾千毫升），并且可W有效 的控制批間差異。該是目前流行的陽性血清的制備方法無法做到的。另外，我們用I班Fc 與抗血清中的IgG連接，相比于用I班與IgG連接的陽性血清的分子量小，該樣就可W盡量 避免交叉反應(yīng)的發(fā)生，提高特異性的同時(shí)，在陽性血清上有效的保留了二抗的結(jié)合位點(diǎn)。
[0021] 本發(fā)明方法可批量制備各種過敏原的陽性血清，解決了檢測(cè)試劑盒制備過程中的 陽性質(zhì)控問題，也可W作為校準(zhǔn)品的生產(chǎn)原料，并且本制備方法簡(jiǎn)單易行。
【附圖說明】
[0022] 附圖1為兔抗柳樹IgG-I班分離純化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于W下實(shí)施 例。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可W根據(jù)具體使用的不同要求做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施 條件為本行業(yè)中的常規(guī)條件。
[0024] 實(shí)施例1
[00巧](一）過敏原的免疫和兔抗血清效價(jià)測(cè)定
[0026] 材料與儀器
[0027] 1、過敏原；過敏原凍干粉，過敏原為牛肉；
[0028] 2、佐劑；弗氏完全佐劑，購自sigma公司，貨號(hào)（F5881);弗氏不完全佐劑，購自 sigma公司，貨號(hào)（F5506);
[0029] 3、動(dòng)物；選3只（每種過敏原免疫3只兔子）2月齡、體重1. 5~2. 0kg的健康新 西蘭大白兔；
[0030] 4、二抗：HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG;
[0031] 5、耗材；H通器、一次性注射器、移液器等。
[00礎(chǔ)免疫步驟
[0033] 1、免疫過敏原準(zhǔn)備：用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法來確定凍干粉溶解后過敏原的濃度，取 4mg過敏原，并用PBS將其稀釋至600yL，用H通器將過敏原與完全佐劑或不完全佐劑（過 敏原V:佐劑V= 6:5)乳化，直至將一滴乳液滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散則過敏原準(zhǔn)備好。 首次免疫用弗氏完全佐劑，后續(xù)免疫均用弗氏不完全佐劑。
[0034] 2、動(dòng)物免疫：將購買的3只新西蘭大白兔在動(dòng)物房養(yǎng)殖1周，使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境；將 制備好的乳液，用1ml注射器進(jìn)行頸部或背部皮下免疫注射，每只新西蘭大白兔注射3點(diǎn)， 每點(diǎn)注射300yL;免疫周期為14天。
[00巧]3、抗血清的制備：每只動(dòng)物免疫前先于一側(cè)耳緣靜脈抽取2血血（作為空白對(duì) 照），之后每次免疫14天，下次免疫前進(jìn)行耳緣靜脈取血用于抗血清評(píng)價(jià)；取血后取下針 頭，將注射器中的血緩緩轉(zhuǎn)移至離也管中，于4C冰箱中過夜，取上清即為血清，析出淡黃色 抗血清；將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中，血凝塊W1500xg離也lOmin。吸出上清液合并收集到 的抗血清管中；抗血清分裝保存于一7(TC。
[0036] 4、抗血清效價(jià)的測(cè)定；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbent assay;ELISA)，用包被緩沖液將過敏原（牛肉）稀釋至10yg/ml，除陰性孔外每孔加 100yL即1yg，4°C包被過夜；陰性對(duì)照1包被1yg羊肉過敏原，4°C包被過夜；陰性對(duì)照2 包被1yg花生過敏原，4°c包被過夜；空白對(duì)照1為動(dòng)物免疫開始前的血清；空白對(duì)照2為 不含一抗抗體的一抗賠育封閉液；空白對(duì)照3為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG賠育封閉液；其余孔 為按1:100、1:200倍比稀釋的抗血清，進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。每次效價(jià)測(cè)定時(shí)平行進(jìn)行上次收集 抗血清的效價(jià)測(cè)定，免疫前后抗血清效價(jià)相近時(shí)，則可W終止免疫殺兔取血，如果效價(jià)還有 明顯提高則繼續(xù)免疫。
[0037] W牛肉免疫兔后抗血清評(píng)價(jià)結(jié)果表1 :
[0038] 表 1
[0039]
[0040]
[0041] 注；A列數(shù)據(jù)為免疫6次后測(cè)定的抗血清效價(jià)；B列數(shù)據(jù)為免疫7次后測(cè)定的抗血 清效價(jià)
[0042] 從上述表格中可W看出兔免疫6次和7次后，抗血清效價(jià)基本趨于穩(wěn)定，按照實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)的血清梯度為1:100-1:1600000,其中當(dāng)血清稀釋至1 ;51200時(shí)，0D值為空白孔 的2倍左右，判斷為陽性有效價(jià)，但當(dāng)再進(jìn)行稀釋時(shí)0D值基本等于空白值或不到空白對(duì)照 值的兩倍，判斷為無效價(jià)。A1-A2和B1-B2為陰性對(duì)照，從數(shù)值可W看出獲取的兔抗血清與 其他過敏原沒有反應(yīng)性；A3-A5和B3-B5為空白對(duì)照，可W看出過敏原與免疫前的兔血清、 與二抗均不會(huì)產(chǎn)生非特異反應(yīng)；其他孔的反應(yīng)為牛肉過敏原和兔抗牛肉過敏原的特異性反 應(yīng)。
[0043] (二）抗血清的親和純化
[0044] 材料與儀器
[004引 1、Protein-Ase地arose化-4B;蠕動(dòng)粟；離也管；離也機(jī)；過濾器；玻璃柱；分光 光度