鑒定骨髓中是否存在保護(hù)白血病干細(xì)胞微環(huán)境的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及白血病診斷和治療試劑盒領(lǐng)域，更具體地講，涉及鑒定骨髓中是否存在保護(hù)白血病干細(xì)胞微環(huán)境的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，白血病的治療方法和藥物，主要是針對(duì)白血病(干)細(xì)胞(leukemiapropagating cells, LPCs)自身進(jìn)行設(shè)計(jì)和使用，雖然能緩解疾病,但是不能清除病人體內(nèi)所有的白血病細(xì)胞，因此導(dǎo)致復(fù)發(fā)；更準(zhǔn)確地說(shuō)，現(xiàn)有的治療方法或藥物，不能清除骨髓中殘留的LPCs。這是由于治療過(guò)程中，骨髓中會(huì)形成特殊的微環(huán)境(niche)對(duì)殘留LPCs進(jìn)行保護(hù)，使得現(xiàn)有的治療方法和藥物，不能清除這些細(xì)胞，導(dǎo)致復(fù)發(fā)。
[0003]目前已有報(bào)道白血病細(xì)胞浸潤(rùn)骨髓會(huì)改造或破壞骨髓微環(huán)境，但是，因?yàn)槿狈m當(dāng)?shù)姆椒ɑ蚣夹g(shù)，還沒(méi)有鑒定到任何白血病干細(xì)胞特定的保護(hù)niche,也沒(méi)有針對(duì)該niche的治療藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，提供一種鑒定骨髓中是否存在保護(hù)白血病干細(xì)胞微環(huán)境的試劑盒。
[0005]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，通過(guò)阻斷保護(hù)白血病干細(xì)胞微環(huán)境形成和干擾其保護(hù)LPCs，找到可干預(yù)該微環(huán)境形成和解除對(duì)LPCs保護(hù)的靶點(diǎn)，提供針對(duì)這些靶點(diǎn)的抑制劑和/或中和抗體在制備提高白血病化療效果藥物中的應(yīng)用。
[0006]為了解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了鑒定骨髓中是否存在保護(hù)白血病干細(xì)胞微環(huán)境的試劑盒，其特征在于，所述保護(hù)白血病干細(xì)胞微環(huán)境為NSM微環(huán)境，所述NSM微環(huán)境早期為Nestin+基質(zhì)干細(xì)胞，隨后轉(zhuǎn)變成a -SMA+基質(zhì)細(xì)胞，所述Nestin+基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CCRl、Vimentin、LepR、0)51和0)29,所述a -SMA+基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Vimentin,所述試劑盒包括下述抗Nestin、抗a -SMA、抗CCRl、抗Vimentin、抗LepR、抗0)51和抗0)29的抗體中的一個(gè)或多個(gè)。
[0007]為了解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了 CCL3抑制劑、抗CCL3中和抗體、CCL3受體CCRl抑制劑或者抗CCRl中和抗體在制備提高白血病化療效果藥物中的應(yīng)用。
[0008]作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述受體抑制劑為BX471。
[0009]為了解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了⑶F15抑制劑或抗⑶F15中和抗體在制備提高白血病化療效果藥物中的應(yīng)用。
[0010]作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述⑶F15抑制劑為干擾RNA i⑶F15。
[0011]為了解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了蛋白酶Furin抑制劑或抗Furin中和抗體在制備提高白血病化療效果藥物中的應(yīng)用。
[0012]作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述Furin抑制劑為CMK。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)保護(hù)LPCs微環(huán)境，命名為NSM-niche，并開(kāi)發(fā)出鑒定白血病患者骨髓中NSM-niche是否存在的試劑盒。通過(guò)鑒定患者骨髓中是否存在NSM-niche，能準(zhǔn)確判斷疾病進(jìn)展和預(yù)后。根據(jù)LPCs的保護(hù)機(jī)制，找到可干預(yù)該微環(huán)境形成和解除對(duì)LPCs保護(hù)的靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)的抑制劑和/或中和抗體可用于制備提高白血病化療效果的藥物，有利于清除病人體內(nèi)殘留的LPCs，最終治愈白血病。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1總體技術(shù)方案圖。
[0015]圖2白血病細(xì)胞在骨髓中的浸潤(rùn)和保護(hù)微環(huán)境的形成。A，實(shí)時(shí)成像觀察，GFP標(biāo)記的白血病細(xì)胞在骨髓中的動(dòng)態(tài)浸潤(rùn)和破壞。B，實(shí)時(shí)成像觀察用Ara-C化療2-4天后，白血病細(xì)胞殘留在骨髓中。C，HE染色顯示保護(hù)微環(huán)境(niche)形成，圍繞并庇護(hù)殘留白血病細(xì)胞。
[0016]圖3鑒定骨髓中形成保護(hù)niche的組成細(xì)胞。A_D，Ara-C化療2天(A2D)時(shí)niche組成細(xì)胞的表型分析。E-F，Ara-C化療4天(A4D)時(shí)niche組成細(xì)胞的表型分析。G，化療2天時(shí)niche組成細(xì)胞的功能成球?qū)嶒?yàn)。H, A2D時(shí)niche組成細(xì)胞的誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。注:早期A2D時(shí)niche組成細(xì)胞為Nestin+基質(zhì)干細(xì)胞，稍晚A4D時(shí)轉(zhuǎn)為a -SMA+,因此稱(chēng)該niche為 NSM-niche。
[0017]圖4NSM_niche的形成機(jī)制。A_B，NSM-niche中殘留白血病細(xì)胞高表達(dá)并分泌細(xì)胞因子。C-D，細(xì)胞因子CCL3招募Nestin+的基質(zhì)干細(xì)胞。E，細(xì)胞因子CCL3擴(kuò)增所招募Nestin+的基質(zhì)干細(xì)胞，形成NSM-niche。F，TGF-β I誘導(dǎo)Nestin+基質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)為a-SMA+細(xì)胞。G，NSM-niche形成模式圖。
[0018]圖5NSM_niche保護(hù)LPCs機(jī)制。A_B，NSM-niche所保護(hù)的白血病細(xì)胞耐藥。C-D，白血病細(xì)胞分泌⑶F15。E，RT-PCR檢測(cè)NSM-niche細(xì)胞表達(dá)蛋白酶Furin。F-1,免疫熒光檢測(cè)，NSM-niche提供蛋白酶Furin處理⑶F15，使其成熟。J-L，成熟的⑶F15激活白血病細(xì)胞的TGF-β信息通路。Μ，成熟的⑶F15使白血病細(xì)胞耐藥。N，NSM-niche保護(hù)LPCs的模式圖。
[0019]圖6抑制或干擾CCL3可以阻斷NSM-niche的形成并明顯提高化療效果。A_C，在白血病小鼠，用CCL3/CCR1抑制劑BX471。骨髓組織HE染色(A)顯示niche的形成被明顯抑制，雖然不影響niche細(xì)胞由Nestin+向a-SMA+轉(zhuǎn)化(B)，但能明顯提高化療(A2D，和A4D)效果，清除更多白血病細(xì)胞(C)。D-F,在白血病小鼠，用抗CCL3的中和抗體，可以同樣抑制NSM-niche的形成，提高化療效果。
[0020]圖7抑制或干擾⑶F15的功能可以明顯提高化療效果。A-B，慢病毒載體介導(dǎo)的⑶F15干擾RNA(i⑶F15)抑制⑶F15的表達(dá)。C_E，i⑶F15的使用明顯提高化療(A2D和A4D)效果，清除NSM-niche中的白血病細(xì)胞。F，為統(tǒng)計(jì)圖。G，用i⑶F15小鼠生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。H，用抗⑶F15的中和抗體，明顯提高化療效果。
[0021]圖8使用Furin抑制劑CMK明顯提高化療效果。A, western blot檢測(cè)骨髓液，CMK抑制pro-GDF15向mGDF15轉(zhuǎn)化。B, HE染色骨髓組織。C，骨髓實(shí)時(shí)成像，顯示CMK的使用，明顯促進(jìn)化療(用Ara-C兩天，A2D)清除白血病細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0023]實(shí)施例1.發(fā)現(xiàn)并鑒定白血病骨髓中保護(hù)LPCs微環(huán)境
[0024]試驗(yàn)總體技術(shù)方案如圖1所示，包括以下步驟:
[0025]1.人性化白血病和化療模型的建立。將熒光蛋白GFP標(biāo)記的人白血病細(xì)胞移植給免疫缺陷小鼠(NOD-SCID IL2Gnu11，NOG),建立人性化白血病模型，之后用化療藥物阿糖胞苷(Ara-C)進(jìn)行治療 2-4 天(A2D，A4D)。
[0026]2.用實(shí)時(shí)成像技術(shù)檢測(cè)白血病細(xì)胞在骨髓中殘留和行為。從左心室注射DiI染料顯示血管結(jié)構(gòu)，立即處死小鼠，取頭蓋骨于半固體培養(yǎng)基中，用共聚焦顯微鏡進(jìn)行ex vivo成像，觀察白血病細(xì)胞的殘留和行為。
[0027]3.取股骨的骨髓組織，進(jìn)行免疫熒光等方法原位分析各種標(biāo)志分子，包括Nestin、 a-SMA、Vimentin、CCRl、LepR、CD51、CD29 等。
[0028]4.分離骨髓中分白血病細(xì)胞，用RNA-microarray和定量RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)譜，特別分析細(xì)胞因子的表達(dá)。
[0029]5.分離骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞，用免疫熒光和流式細(xì)胞儀等方法分析了其免疫表型分子，用體外成球和分化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)器自我更新和分化潛能。
[0030]通過(guò)實(shí)時(shí)成像等技術(shù)我們檢測(cè)到，白血病細(xì)胞浸潤(rùn)骨髓，在實(shí)質(zhì)性破壞骨髓正常結(jié)構(gòu)的情況下，給予化療。基質(zhì)細(xì)胞在骨髓中形成新的微環(huán)境(niche)。該niche提供庇護(hù)，使白血病細(xì)胞免受化療藥物的殺滅，見(jiàn)圖2。圖2為白血病細(xì)胞在骨髓中的浸潤(rùn)和保護(hù)微環(huán)境的形成。A，實(shí)時(shí)成像觀察，GFP標(biāo)記的白血病細(xì)胞在骨髓中的動(dòng)態(tài)浸潤(rùn)和破壞。B，實(shí)時(shí)成像觀察用Ara-C化療2-