一種腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定量檢測(cè)試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑，具體地說是一種腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定量檢測(cè)試劑 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 滲出是局部組織器官內(nèi)的液體和細(xì)胞成分進(jìn)入組織間質(zhì)、體腔、粘膜表面和體表 的過程。組織滲液中含有大量脫落細(xì)胞，還含有蛋白質(zhì)、糖、甘油三脂、膽固醇和纖維蛋白原 破壞放出的凝血活酶。
[0003] 在抑癌基因P53發(fā)生突變的組織細(xì)胞中，失去了P53對(duì)糖代謝戊糖磷酸途徑限 速酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的抑制，葡萄糖通過戊糖磷酸途徑代謝，產(chǎn)生大量還原型輔酶 II(NADPH)。NADPH作為谷胱甘肽還原酶的輔酶，使氧化型谷胱甘肽（GSSG)還原成為還原 型谷胱甘肽（GSH)，細(xì)胞內(nèi)GSH含量增高。谷胱甘肽過氧化物酶以還原型谷胱甘肽（GSH) 作為供氫體來分解H202，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG)，使細(xì)胞內(nèi)GSH:GSSG的比率下降。 GSH生成GSSG過程中形成細(xì)胞的低氧及還原性狀態(tài)，激活氧感受器和缺氧信號(hào)傳導(dǎo)通 路，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的巰基由氧化型向還原型轉(zhuǎn)變，促使缺氧特異性轉(zhuǎn)錄因子-低氧誘導(dǎo)因子 (hypoxia-induciblefactor;HIF_la)的磷酸化并與HIF-lb結(jié)合而形成一個(gè)完整的HIF-1 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，與相應(yīng)靶基因上的缺氧反應(yīng)元件（HRE)結(jié)合，促進(jìn)靶基因的表達(dá)。還通過第二 信使-活性氧族（R0S)與激酶系統(tǒng)發(fā)生聯(lián)系，激活激酶系統(tǒng)。上述變化產(chǎn)生一種親脂性物 質(zhì)（Hydrophilicfattymolecules)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞血紅素結(jié)合蛋白（HP蛋白）的疏水核內(nèi)， 改變蛋白質(zhì)a鏈⑶3His和0鏈⑶3Ser、E10Lys的極性量值，使位居其疏水核中的原血紅 素脫落，成為腫瘤組織細(xì)胞原血紅素，簡稱TCPH。這種腫瘤組織細(xì)胞原血紅素是一種酶樣物 質(zhì)，具有過氧化物酶樣作用。經(jīng)過特定的氧化-還原反應(yīng)使細(xì)胞內(nèi)的酶染色，觀察細(xì)胞酶的 顯色情況即可測(cè)及腫瘤組織細(xì)胞原血紅素。腫瘤性滲出組織滲液中的脫落腫瘤細(xì)胞可能含 有腫瘤組織細(xì)胞原血紅素（Theprotohemeoftumorcells，TCPH)，而組織滲液中是否含有 腫瘤組織細(xì)胞原血紅素對(duì)組織滲液性質(zhì)的鑒定具有重要意義。
[0004] 經(jīng)檢索，目前尚無腫瘤組織細(xì)胞原血紅素（TCPH)定量檢測(cè)試劑。本發(fā)明試劑的檢 測(cè)目的物是腫瘤組織細(xì)胞原血紅素（Theprotohemeoftumorcells，TCPH)，這是一種新近 發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤組織細(xì)胞產(chǎn)生的生物因子。目前，本發(fā)明試劑是唯一能實(shí)現(xiàn)對(duì)該生物因子 的定量檢測(cè)的試劑。近期已有《全自動(dòng)腫瘤組織細(xì)胞原血紅素檢測(cè)分析儀》設(shè)計(jì)成功，苦無 配套試劑。為此，特設(shè)計(jì)了一種可供上述自動(dòng)化分析儀器使用的腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定 量檢測(cè)試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定量檢測(cè)試劑。本發(fā)明制備的 試劑準(zhǔn)確、方便、快速，以讀取吸光度的方法、在全自動(dòng)分析儀器上定量檢測(cè)組織滲液中腫 瘤組織細(xì)胞原血紅素（TCPH)的含量。
[0006] 本發(fā)明還提供了上述腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定量檢測(cè)試劑的制備方法。
[0007] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定量檢測(cè)試劑，其特征在于，它是由試劑A和試劑B組 成；所述試劑A由0.3g/L~0.9g/L的3,3'，5,5' -四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸、6g/L~24g/L的聚 乙烯吡咯烷酮K30、6ml/L~12ml/L的6-甲氧基喹啉、7. 98g/L~12. 33g/L的二甲基亞砜、 0. 01~0.lmol/LpH值為3. 2~6. 8磷酸鹽緩沖液組成；所述試劑B為1%的過氧化氫溶液。
[0008] 所述試劑A與試劑B的體積比為1:1。
[0009] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述試劑A是由0.6g/L的3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺二 鹽酸、12g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30、10g/L的二甲基亞砜、8ml/L的6-甲氧基喹啉、0.lmol/ LpH值為5. 5的磷酸鹽緩沖液組成。
[0010] 上述腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定量檢測(cè)試劑的制備方法，它包括以下步驟： 1) 先將3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸溶解于10ml二甲基亞砜中； 2) 配制磷酸鹽緩沖液； 3) 取890ml步驟2)所制的緩沖液，將步驟1)所得溶液與其混合均勻； 4) 向步驟3)所得混合溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮K30,充分?jǐn)嚢枋怪耆芙猓?5) 向步驟4)所得混合溶液中加入6-甲氧基喹啉，并用步驟2)所制磷酸鹽緩沖液定容 至1000ml，混合均勻即配制成試劑A; 6) 將試劑A與1%的過氧化氫溶液等體積混合后即得腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定量檢測(cè) 試劑。
[0011] 本發(fā)明試劑的測(cè)試原理如下：腫瘤組織細(xì)胞原血紅素是一種酶樣物質(zhì)，具有過氧 化物酶樣作用，具備水解過氧化物的能力。腫瘤細(xì)胞原血紅素與過氧化物反應(yīng)，摘取過氧化 物的氧原子，并與氧原子結(jié)合形成氧化型腫瘤細(xì)胞原血紅素；氧化型腫瘤細(xì)胞原血紅素極 不穩(wěn)定，迅即又脫掉氧原子傳遞給供氫體四甲基聯(lián)苯胺，使原本不含發(fā)色集團(tuán)的供氫體3， 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺脫氫，生成含發(fā)色集團(tuán)醌基的藍(lán)色物質(zhì)聯(lián)苯胺藍(lán)。樣本內(nèi)若不含有 腫瘤組織細(xì)胞原血紅素，則無聯(lián)苯胺藍(lán)生成，因之不顯色；樣本內(nèi)若含有腫瘤組織細(xì)胞原血 紅素，則有聯(lián)苯胺藍(lán)生成，反應(yīng)液逐漸呈現(xiàn)藍(lán)色。顯色的深淺與樣本內(nèi)含有的腫瘤組織細(xì)胞 原血紅素成正比。如此，測(cè)定反應(yīng)液顯色的吸光度即可測(cè)及樣本內(nèi)腫瘤組織細(xì)胞原血紅素 的含量。
[0012] 本發(fā)明試劑的使用方法如下：使用本發(fā)明制備的定量檢測(cè)原血紅素分析試劑，在 全自動(dòng)腫瘤組織細(xì)胞原血紅素檢測(cè)分析儀上進(jìn)行測(cè)試。首先分析儀以試劑加樣針自動(dòng)在試 劑倉內(nèi)吸取200yL本發(fā)明制備的試劑加入比色管中，再以樣本加樣針自動(dòng)在樣本瓶內(nèi)吸 取200yL樣本加入比色管中，37 °C溫育使試劑與樣本充分反應(yīng)。在反應(yīng)144秒的時(shí)間點(diǎn)上， 以光電比色法自動(dòng)讀取該樣本與本發(fā)明制備的試劑反應(yīng)后顯色液的吸光度，以此吸光度值 通過儀器設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取相對(duì)應(yīng)的腫瘤組織細(xì)胞原血紅素的含量值。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明制備的試劑準(zhǔn)確、方便、快速，以直接讀數(shù)的定量方 法、在全自動(dòng)分析儀器上批量檢測(cè)組織滲液中腫瘤組織細(xì)胞原血紅素（TCPH)的含量，其穩(wěn) 定性好，該試劑在低溫干燥環(huán)境下可以穩(wěn)定保存2年；此外，它的準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè) 靈敏度也可達(dá)到10yg/L。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0015] 實(shí)施例1 腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定量檢測(cè)試劑的制備 1) 先將〇.3g的3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸溶解于10ml二甲基亞砜中； 2) 配制pH為3. 2濃度為0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液； 3) 取890ml步驟2)所制的緩沖液，將步驟1)所得溶液與其混合均勻； 4) 向步驟3)所得混合溶液中加入6g聚乙烯吡咯烷酮K30,充分?jǐn)嚢枋怪耆芙猓?5) 向步驟4)所得混合溶液中加入6-甲氧基喹啉6ml，并用步驟2)所制磷酸鹽緩沖液 定容至1000ml，混合均勾即配制成試劑A; 6) 將試劑A與1%的過氧化氫溶液等體積混合后即得腫瘤組織細(xì)胞原血紅素定量檢測(cè) 試劑。
[0016] 實(shí)施例2 腫瘤組織