一種用于確定小麥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)侵染小麥組織的染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及真菌染色技術(shù)，特別是一種采用Wheat Germ Agglutinin, Alexa F丨uorK 488Conjugate(WGA_AF 488)染劑標(biāo)記小麥黑糖菌（Tilletia controversa KUhn)從而確定小麥組織是否被侵染的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kilhn, TCK)屬真菌界黑粉菌科腥黑粉 菌屬，是引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國際檢疫性病害，對小麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重的危 害，也是我國外來生物入侵研究的主要物種之一。
[0003] 基于形態(tài)學(xué)觀察和鑒定目的的常見的真菌染色方法包括：高碘酸無色品紅法 (PAS法）、HE染色、六胺銀法（GMS法）、黏液胭脂紅法（Mucincarmine法）、阿爾辛藍(lán)法（AB 法）、無色品紅醛品紅法（Gridley法）等，但這些方法都不能獲得較好的TCK染色效果。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中存在一種根據(jù)黑穂病菌的自發(fā)熒光顯微學(xué)特性甄別小麥矮腥黑穗病 菌和小麥網(wǎng)腥黑穗病菌（T. carves Tul.，TCT)的方法，即，在Strockwell等人的方法上做 了相應(yīng)的改進(jìn)，能夠在觀察數(shù)量足夠多的情況下很好地鑒別TCK和TCT。
[0005] 同樣屬于黑粉菌科的茭白黑粉菌，現(xiàn)有技術(shù)中有一種快速觀察其菌絲的方法，即 Latude-Dada(1996)方法的改進(jìn)，包括：首先在脫色液（0. 15%三氯乙酸溶解在3 : l(w/v) 的乙醇和氯仿混合液中）中脫色，蒸餾水漂洗3次后，用0. 025%苯胺藍(lán)乳酚油染色液進(jìn)行 染色，然后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察即可。
[0006] 然而，目前該領(lǐng)域尚未存在一種能夠?qū)崿F(xiàn)在任意生長階段的各種小麥組織中獲得 較好的黑穂菌染色效果并確認(rèn)該小麥組織是否被侵染的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 基于本領(lǐng)域如上所述的空白和需求，本發(fā)明提供了一種用于確定小麥黑穗菌 (Tilletia controversa KUhn)侵染小麥組織的染色方法。技術(shù)方案如下：
[0008] -種用于確定小麥黑穗菌（Tilletia controversa Kilhn)侵染小麥組織的染色方 法，包括如下步驟：
[0009] (1)固定：取不同生長時(shí)期的小麥組織樣品，在無水乙醇固定液浸泡不少于24h ;
[0010] (2)染色：將樣品先置于含 10 μ g/ml Propidium Idodide 和 0· 〇2% Tween2O 的 A 染色液中浸泡15min，然后置于20 μ g/ml WGA-AF 488的B染色液中20min，最后用I XPBS pH 7. 4沖洗；
[0011] (3)將處理后樣品置于載玻片上加蓋玻片倒置后在激光共聚焦顯微鏡下觀察是否 有菌絲侵染。
[0012] 所述小麥組織樣品指葉片、莖桿、花藥或子房。
[0013] 所述小麥組織樣品指葉片，需剪段成5mm左右的方塊且去掉四周邊緣。
[0014] 所述小麥組織樣品指孕穗期樣品，需分離子房和花藥。
[0015] 所述的染色方法在用于確定小麥黑穗菌侵染小麥組織方面的應(yīng)用。
[0016] 一種用于確定小麥黑穗菌侵染小麥組織的試劑盒，特征在于，包括:A染色液和B 染色液，A染色液是含10 μ g/ml Propidium Idodide的0· 02% Tween20溶液，B染色液是 20 μg/ml WGA-AF 488。
[0017] 所述試劑盒還包括用于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的常規(guī)試劑：1XPBS pH 7. 4、無水乙醇、蒸餾 水。
[0018] -種用于確定小麥黑穗菌侵染小麥組織的試劑盒的生產(chǎn)方法，其特征在于，組裝 試劑盒的試劑中包括A染色液和B染色液，A染色液是含10 μ g/ml Propidium Idodide的 0· 02% Tween20 溶液，B 染色液是 20 μ g/ml WGA-AF 488〇
[0019] 組裝試劑盒的試劑中還包括IXPBS pH 7. 4、無水乙醇、蒸餾水。
[0020] 本發(fā)明請求保護(hù)一種用于確定小麥黑穗菌（Tilletia controversa KUhn)侵染小 麥組織的染色方法，包括如下步驟：（1)固定：取不同生長時(shí)期的小麥組織樣品，在無水乙 醇固定液中充分浸泡；（2)染色：將樣品先置于含10 μ g/ml Propidium Idodide和0. 02% Tween20的溶液中浸泡15min，然后置于20μg/ml WGA-AF 488的染色液中20min，最后用 IXPBS pH 7.4沖洗；（3)將處理后樣品置于載玻片上加蓋玻片倒置后在激光共聚焦顯微 鏡下觀察是否有菌絲侵染。該方法的技術(shù)原理如下：麥胚凝集素（WGA)是一種在細(xì)胞生物 學(xué)中的應(yīng)用最為廣泛的外源凝集素 。Alexa FIuorK 488共輒WGA具有明亮的綠色熒光（激 發(fā)/發(fā)射波長為495/519nm)，它具有與真菌胞壁的幾丁質(zhì)相結(jié)合的特性，因此利用該染色 劑能很好地實(shí)現(xiàn)對黑穂菌的標(biāo)記功能。
[0021] 該方法首次使用WGA-AF 488染劑標(biāo)記小麥矮腥黑穗菌絲，Propidium Idodide 染劑用來浸染小麥組織，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到小麥各個(gè)生長時(shí)期的不同組織中的 TCK侵染情況，用于確定所測小麥組織對應(yīng)的小麥植株是否感染了 TCK。上述步驟十分簡 單、便捷，無需特殊的實(shí)驗(yàn)條件和處理手段，在一般的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中均能操作實(shí)現(xiàn)，且便于推 廣。
[0022] 進(jìn)一步地，所述小麥組織樣品指葉片、莖桿、花藥或子房；采用本發(fā)明的染色方法， 可以使用小麥各個(gè)部位的組織作為樣品進(jìn)行染色，突破了不同生長時(shí)期對于小麥組織取樣 的局限性，能夠通過簡單便捷的方式在小麥生長的任一階段取樣染色并獲知確認(rèn)所測小麥 是否感染TCK。
[0023] 進(jìn)一步地，所述小麥組織樣品指葉片，需剪段成5_左右的方塊且去掉四周邊緣， 有利于染色劑從四周進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
[0024] 進(jìn)一步地，所述小麥組織樣品指孕穗期樣品，需分離子房和花藥；該步驟可以實(shí)現(xiàn) 在小麥孕穗期取樣以確定該孕穗期小麥植株是否被黑穂菌侵染。
[0025] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，通過本發(fā)明提供的染色方法，能夠?qū)π←湼魃L時(shí)期 的感染組織進(jìn)行成功染色，并獲得清晰的染色效果。
[0026] 根據(jù)市場需求，本發(fā)明還請求保護(hù)基于所述染色方法的用于確定小麥黑穗菌侵染 小麥組織的試劑盒。組裝所述試劑盒的試劑包括規(guī)格如下的染色劑：A染色液：含10 μ g/ ml Propidium Idodide 的 0· 02% Tween20 溶液，B 染色液：20 μ g/ml WGA-AF 488 ;所述試 劑進(jìn)一步地還包括用于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的常規(guī)試劑，如IXPBS pH 7. 4、無水乙醇、蒸餾水等。采 用所述試劑盒按照本發(fā)明染色方法的步驟對小麥組織樣品進(jìn)行染色，同樣能在各時(shí)期不同 的小麥組織中獲得清晰的染色效果，并確認(rèn)所測組織對應(yīng)的小麥有沒有感染黑穂菌。
[0027] 本發(fā)明還請求保護(hù)上述試劑盒的生產(chǎn)方法，即任何規(guī)模的基于商業(yè)目的的組裝或 生產(chǎn)上述用于確定小麥黑穗菌侵染小麥組織的試劑盒的行為均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028] 綜上所述，采用本發(fā)明的染色方法能夠?qū)崿F(xiàn)在任意生長階段的各種小麥組織中獲 得較好的黑穂菌染色效果并確認(rèn)該組織對應(yīng)的小麥植株是否被黑穂菌侵染，同時(shí)在對于研 究小麥矮腥黑穗病的侵染循環(huán)方面，由于在目前國內(nèi)外開展的一些對小麥矮腥黑穗病侵染 循環(huán)對的研究中，尚未見采用此方法獲得黑穂菌侵染循環(huán)染色結(jié)果的報(bào)道，因此本發(fā)明所 述的方法更具有實(shí)際應(yīng)用意義。本發(fā)明的染色方法具有操作簡單、便捷、有