一種基于寬帶受激輻射的納米o(hù)ct成像方法及系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及OCT技術(shù)、受激輻射探測(cè)技術(shù)以及受激輻射損耗（Stimulated Emission Depletion，STED)顯微術(shù)，具體涉及一種基于寬帶受激福射的納米OCT成像方法 及系統(tǒng)。 技術(shù)背景
[0002] 隨著生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的飛速發(fā)展，納米分辨技術(shù)越來(lái)越受到研究人員的重視。一方 面，為了更好地理解人體生命的作用過(guò)程與疾病的形成機(jī)理，人們需要觀察細(xì)胞內(nèi)器官、病 毒、寄生蟲(chóng)等在二維細(xì)胞空間的精確定位和分布。另一方面，后基因組時(shí)代蛋白質(zhì)科學(xué)的研 究也要求闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、定位與功能的關(guān)系以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用的時(shí) 空順序；生物大分子，主要是結(jié)構(gòu)蛋白與RNA及其復(fù)合物，如何組成細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)體系； 重要的活性因子如何調(diào)節(jié)細(xì)胞的主要生命活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞信 號(hào)傳遞等。反映這些體系性質(zhì)的特征尺度都在納米量級(jí)，由此對(duì)相應(yīng)的觀測(cè)手段提出了更 高的要求。
[0003] 目前，基于熒光的超分辨顯微方法主要有以下幾類：第一類光學(xué)超分辨技術(shù)利用 熒光分子的光開(kāi)光效應(yīng)，采用極低光強(qiáng)的激活光使得同一時(shí)間只有極少數(shù)、稀疏的熒光分 子被激活，具備發(fā)射熒光的能力。此時(shí)，這些熒光分子所發(fā)出的熒光將不會(huì)由于衍射效應(yīng) 而發(fā)生空間上的串?dāng)_，相應(yīng)的熒光分子也將可以被一一區(qū)分并通過(guò)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)數(shù)字化的方 法計(jì)算出中心位置。反復(fù)這一過(guò)程逐個(gè)獲取數(shù)微米尺度范圍內(nèi)所有熒光分子的中心位置， 最后疊加重構(gòu)成一幅完整的圖像，即可實(shí)現(xiàn)超分辨顯微。第二類光學(xué)超分辨技術(shù)稱為光學(xué) 波動(dòng)成像法（S0FI)，由Dertinger等人于2009年提出。SOFI利用熒光分子連續(xù)發(fā)光時(shí)發(fā) 光強(qiáng)度存在波動(dòng)性這一現(xiàn)象，通過(guò)對(duì)一段時(shí)間內(nèi)探測(cè)得到的熒光強(qiáng)度進(jìn)行高階時(shí)間相關(guān)運(yùn) 算，從而提高系統(tǒng)的分辨率。第三類光學(xué)超分辨方法稱為結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)（sno。這種方 法通過(guò)對(duì)照明光源進(jìn)行調(diào)制，將原本不可分辨的高空間頻率信息編碼入熒光圖像中，結(jié)合 計(jì)算解碼獲取高分辨率信息，可將橫向分辨率提高至約l〇〇nm。在熒光飽和情況下，這種技 術(shù)的空間分辨能力可以進(jìn)一步地提高至50nm左右。第四類光學(xué)超分辨方法則是基于光學(xué) 非線性效應(yīng)來(lái)抑制熒光的發(fā)射，減小有效熒光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的橫向尺寸，從而提高系統(tǒng)的分 辨率。由Stefan Hell于1994年提出的STED正是這一類顯微術(shù)中的代表。在STED顯微 術(shù)中，有效熒光發(fā)光面積的減小是通過(guò)受激輻射效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)激發(fā)光的照射使得其衍 射斑范圍內(nèi)的熒光分子被激發(fā)，其中的電子躍迀到激發(fā)態(tài)后，損耗光使得部分處于激發(fā)光 斑外圍的電子以受激輻射的方式回到基態(tài)，其余位于激發(fā)光斑中心的被激發(fā)電子則不受損 耗光的影響，繼續(xù)以自發(fā)熒光的方式回到基態(tài)。由此，有效熒光的發(fā)光面積得以減小，系統(tǒng) 的分辨率得以提高。
[0004] 在生物醫(yī)學(xué)的研究之中，涉及到的樣品除了常見(jiàn)的熒光樣品(本身發(fā)熒光或熒光 染料標(biāo)記）之外，還有一類特殊的非熒光色團(tuán)，如血紅蛋白和細(xì)胞色素。這類物質(zhì)中的電 子在吸收激發(fā)光光子后仍然會(huì)躍迀到激發(fā)態(tài)，但是之后絕大部分將以非輻射的方式回到基 態(tài)，從而導(dǎo)致自發(fā)焚光極其微弱，無(wú)法被探測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于寬帶受激輻射的納米OCT成像方法和系統(tǒng)。本發(fā) 明：1)利用受激輻射而非自發(fā)輻射使處于激發(fā)態(tài)的色團(tuán)快速回到基態(tài)，并采用寬帶探測(cè)光 源實(shí)現(xiàn)受激輻射熒光信號(hào)的相干探測(cè)。2)軸向與橫向分辨率的提高則分別通過(guò)寬帶光源 技術(shù)和受激輻射損耗技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。采用超寬帶光源作為探測(cè)光源，可實(shí)現(xiàn)亞微米至百納米 級(jí)的軸向分辨率。采用基于受激輻射損耗的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)調(diào)控技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)納米級(jí)的橫向 分辨率。3)受激輻射過(guò)程十分迅速，這為生物體的實(shí)時(shí)成像提供了可能。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種基于寬帶受激輻射的納米OCT成像方法： 1) 開(kāi)啟激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行照射，使樣品處于激發(fā)狀態(tài)； 2) 開(kāi)啟激發(fā)光的同時(shí)開(kāi)啟損耗光；損耗光經(jīng)過(guò)光束調(diào)制后形成橫向中空型長(zhǎng)焦光斑； 損耗光照射到樣品上，此時(shí)位于激發(fā)光斑外圍位置上的激發(fā)態(tài)電子將通過(guò)受激輻射的方式 回到基態(tài)，而處于激發(fā)光斑中心附近位置上的激發(fā)態(tài)電子將仍然留在激發(fā)態(tài)上； 3) 關(guān)閉激發(fā)光和損耗光，開(kāi)啟探測(cè)光，將留在激發(fā)態(tài)上的電子通過(guò)受激輻射的方式送 回基態(tài)； 4) 受激輻射熒光與樣品發(fā)生相互作用，形成后向散射信號(hào)；這些信號(hào)光再次入射到分 光鏡上，與從參考光路返回的參考光匯合并形成干涉，干涉光由快速光譜儀探測(cè)；通過(guò)分析 干涉光譜在傅里葉域上的強(qiáng)度，便可以得到之前處于激發(fā)態(tài)電子的數(shù)量，繼而表征出樣品 中熒光色團(tuán)或非熒光色團(tuán)的分布。
[0007] -種基于寬帶受激輻射的納米OCT成像系統(tǒng)，包括時(shí)序控制器、激發(fā)光源、損耗光 源、光束調(diào)制模塊、探測(cè)光源、平面反射鏡、信號(hào)采集和處理模塊和樣品臂；樣品臂包括二維 掃描振鏡和顯微物鏡； 激發(fā)光源出射的激發(fā)光束首先被導(dǎo)入第一單模光纖，之后依次通過(guò)第一準(zhǔn)直透鏡，以 及平面鏡反射進(jìn)入樣品臂；由損耗光源發(fā)出的損耗光束首先被導(dǎo)入第二單模光纖，由第二 單模光纖出射的光束經(jīng)第二準(zhǔn)直鏡后進(jìn)入光束調(diào)制模塊；之后通過(guò)二向色鏡及平面鏡的反 射進(jìn)入樣品臂；由探測(cè)光源出射的光束被導(dǎo)入第三單模光纖，然后經(jīng)第三準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直，再通 過(guò)分光棱鏡后被分成兩部分，其中透射光作為探測(cè)光，而反射光作為參考光；參考光被平面 反射鏡反射后再次入射到分束棱鏡上；探測(cè)光依次被二色鏡和反射鏡反射，進(jìn)入樣品臂； 進(jìn)入樣品臂的激發(fā)光束、損耗光束和探測(cè)光束通過(guò)二維掃描振鏡后，再經(jīng)顯微物鏡聚焦，投 射到樣品上；來(lái)自樣品的信號(hào)光被顯微物鏡收集，再次通過(guò)二維掃描振鏡，之后被二色鏡反 射，從而與激發(fā)光束和損耗光束分離；被二向色鏡反射的后向散射信號(hào)光入射到分光棱鏡 上被反射，之后與透過(guò)分光棱鏡的參考光形成干涉，并由信號(hào)采集和處理模塊采集并處理； 探測(cè)光源、損耗光源和激發(fā)光源均與時(shí)序控制器連接。
[0008] 與【背景技術(shù)】相比，本發(fā)明具有的有益效果是： 1、較之于傳統(tǒng)的熒光超分辨顯微方法，本發(fā)明同時(shí)融合了 OCT技術(shù)、受激輻射損耗技 術(shù)以及受激輻射探測(cè)技術(shù)。不僅拓展了 OCT的熒光成像功能，并為非熒光色團(tuán)的光學(xué)成像 提供了方法。
[0009] 2、由于OCT的軸向分辨率和橫向分辨率是相互獨(dú)立的。利用超寬帶光源作為探測(cè) 光源，可以實(shí)現(xiàn)百納米級(jí)的軸向分辨率。結(jié)合受激輻射損耗點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)調(diào)控技術(shù)，減小有效 熒光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的橫向尺寸，可以實(shí)現(xiàn)納米級(jí)超高橫向分辨率。
[0010] 3、受激輻射過(guò)程大大快于自發(fā)輻射過(guò)程，這為提高成像速度、實(shí)現(xiàn)生物體的實(shí)時(shí) 觀測(cè)提供了可能。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1是本發(fā)明的成像系統(tǒng)示意圖。
[0012] 圖2是本發(fā)明中的三個(gè)光源的時(shí)序控制圖。
[0013] 圖3是本發(fā)明中與三束光源相關(guān)的電子躍迀能級(jí)圖。
[0014] 圖4是系統(tǒng)的橫向分辨率和軸向分辨率的不意圖。
[0015] 圖1中：1時(shí)序控制器，2激發(fā)光源，3損耗光源，4光束調(diào)制模塊，5探測(cè)光源，6二 維掃描振鏡，7樣品，8平面反射鏡，9信號(hào)采集和處理模塊。虛線框內(nèi)是典型的譜域OCT系 統(tǒng)