一種快捷測定水中mc-rr的量子點(diǎn)熒光檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快捷測定水中MC-RR的量子點(diǎn)熒光檢測方法，屬于分析化學(xué)檢測 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微囊藻毒素（MC)具有肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性及生殖毒性，也是確認(rèn) 的肝癌促進(jìn)劑。藻毒素的結(jié)構(gòu)為環(huán)狀七肽，已知超過60種結(jié)構(gòu)變異體，含量相對較多、毒性 較大的幾種為：LR、RR及YR。MC-RR毒性雖然比MC-LR小，但它含量高，危害甚至比MC-LR大， 而且國內(nèi)還未將MC-RR作為監(jiān)測指標(biāo)。對于MC-RR的檢測研究相對較少，目前以HPLC-MS、 HPLC法為主。但因HPLC-MS法儀器昂貴，樣品制備過程復(fù)雜、耗時長，檢測費(fèi)用高，且對操作 人員要求也較高；HPLC法靈敏度達(dá)不到要求，需要濃縮樣品，前處理繁瑣，且產(chǎn)生大量有毒 的有機(jī)廢液，耗人力、耗時、費(fèi)錢。這限制了這兩種方法在基層檢測機(jī)構(gòu)中的推廣應(yīng)用。因 此，開發(fā)出一種快捷、廉價、簡便且高靈敏度的檢測水及水產(chǎn)品中的MC-RR方法很有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于建立一種快捷、廉價、簡便且高靈敏度的檢測水中MC-RR的方 法。
[0004] 按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案：一種快捷測定水中MC-RR的量子點(diǎn)熒光檢測方法， 步驟如下： (1) 制備水溶性核殼式結(jié)構(gòu)的CdSe/CdS量子點(diǎn) 取合成的有機(jī)相CdSe/CdSlmL，用20yL巰基乙酸轉(zhuǎn)相，正己烷洗滌，干燥，得到CdSe/CdS量子點(diǎn)（QDs)粉末；稱取20mgCdSe/CdS量子點(diǎn)粉末溶于pH= 7. 17的10mL0.02mol/ L的PBS緩沖溶液中，即得到2.Omg/mL水溶性的CdSe/CdS量子點(diǎn)QDs; (2) 制備QDs-MC-RR抗體生物共輒體及反應(yīng)條件的優(yōu)化 將 2mgEDC、0. 5mgNHS和 40ML2.Omg/mL的QDs混合于 2mL0? 02mol/LpH為 7. 17 的PBS緩沖溶液中，混勻后于室溫下孵育30min，加入2ML疏基乙酸終止活化反應(yīng)，5min后向 活化好的QDs溶液中加入IOMLlOnmol/LMC-RR單克隆抗體(蘇州科同生物醫(yī)藥科技有限 公司），37°C恒溫震蕩培養(yǎng)lh，加入IOML0. 04mol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液終止反應(yīng)。 再用100KD的超濾膜離心管1000 Orpm離心純化得到QDs-MC-RR生物共輒體，加入5ML5% 牛血清蛋白溶液封閉； 檢測MC-RR反應(yīng)條件：PBS緩沖溶液pH為7. 17,反應(yīng)時間60min，反應(yīng)溫度37°C，QDs濃度 2.Omg/mL; (3) 檢測MC-RR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 向上述2mLQDs-MC-RR生物共輒體溶液中加入10ML不同濃度的MC-RR，分別為 0.0nmol/L、0.5nmol/L、1.0nmol/L、2.0nmol/L、3.0nmol/L、4.0nmol/L的標(biāo)準(zhǔn)系列，在 400nm激發(fā)波長下QDs-MC-RR生物共輒體的熒光猝滅程度與MC-RR濃度的關(guān)系：該生物共 輒體系的熒光強(qiáng)度與MC-RR濃度在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān)關(guān)系，且符合Lambert-Beer公 式： (F0-Fn) /F0=O. 1103C+0. 02293 (r=0. 99460) F。為未加入MC-RR時QDs-MC-RR生物共輒體的熒光強(qiáng)度；Fn為加入MC-RR后QDs-MC-RR生物共輒體的熒光強(qiáng)度；C為加入MC-RR樣品的濃度，單位：nmol/L; (4)方法精密度及檢出限 MC-RR濃度分別為0. 5nmol/L、2. 0nmol/L、4.Onmol/L時平行測定7次，精密度RSD分別為11. 3%、5. 6%、4. 2% ;MC-RR濃度為0. 25nmol/L時平行測定11次，方法的檢出限為 2. 4X10 10mol/L〇
[0005] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的快捷測定水中MC-RR的量子點(diǎn)熒光檢測方法與 常用的HPLC-MS、HPLC等檢測方法相比，廉價、簡便，配上便攜式熒光儀可用于現(xiàn)場檢測。
【附圖說明】
[0006] 圖1 :水溶性CdSe/CdS量子點(diǎn)的TEM圖。
[0007] 圖2:QDs與QDs-MC-RR生物共輒體的吸收光譜。
[0008] 圖3:QDs與QDs-MC-RR生物共輒體的熒光光譜。
[0009] 圖4 :不同MC-RR濃度下生物共輒體熒光光譜圖，a-f?濃度分別為0. 0,0. 5,1. 0， 2. 0, 3. 0,4. 0nmol/L〇
【具體實施方式】
[0010] 實施例1 一種快捷測定水中微囊藻毒素-RR的量子點(diǎn)熒光檢測方法，包括如下步 驟： 1、 制備水溶性核殼式結(jié)構(gòu)的CdSe/CdS量子點(diǎn) 取20mmolCdO(氧化錦）置于三頸燒瓶中，加入9.6mL油酸和40mL液體石錯，攪拌 加熱到220°C，作為鎘源。取Immol硒粉加到50mL液體石蠟中，攪拌并緩慢加熱到220°C， 作為硒源。取5mL的鎘源，劇烈攪拌下快速注入到硒源中，維持溶液溫度在220°C，加熱30 min得到CdSe量子點(diǎn)。然后降溫到100 °C，并向其中通入H2S氣體，磁力攪拌。反應(yīng)結(jié)束， 溫度緩慢升高到220 °C，回流30min，得到有機(jī)相核殼式CdSe/CdS量子點(diǎn)，（參照文獻(xiàn)Deng 等發(fā)表于J.Phys.Chem.B, 2005，109 (9): 16671)〇
[0011] 取合成的有機(jī)相CdSe/CdSlmL，用20yL巰基乙酸轉(zhuǎn)相，正己烷洗滌，干燥，得 到CdSe/CdS量子點(diǎn)QDs粉末；稱取20mgCdSe/CdS量子點(diǎn)粉末溶于pH= 7. 17的10mL 0. 02mol/L的PBS緩沖溶液中，即得到2.Omg/mL水溶性的CdSe/CdS量子點(diǎn)QDs; 2、 制備QDs-MC-RR生物共輒體及反應(yīng)條件的優(yōu)化 將 2mgEDC、0. 5mgNHS和 40ML2.Omg/mL的QDs混合于 2mL0? 02mol/LpH為 7. 17 的PBS緩沖溶液中，混勻后于室溫下孵育30min，加入2ML巰基乙酸終止活化反應(yīng)，5min后向活 化好的QDs溶液中加入10ML10nmol/LMC-RR單克隆抗體，37°C恒溫震蕩培養(yǎng)lh，加入10ML 0. 04mol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液終止反應(yīng)。再用100KD的超濾膜離心管1000 Orpm離 心純化得到QDs-MC-RR生物共輒體，加入5ML5%牛血清蛋白溶液封閉。
[0012] 優(yōu)化影響生物共輒體熒光猝滅的因素，得到檢測MC-RR最佳實驗條件：pH= 7. 17， 反應(yīng)時間60min，反應(yīng)溫度37°C及CdSe/CdS量子點(diǎn)濃度2.Omg/mL。
[0013] 3、檢測MC-RR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 向上述2mLQDs-MC-RR生物共輒體溶液中加入IOML不同濃度的MC-RR，分別為 0? 0nmol/L、0. 5nmol/L、l. 0nmol/L、2. 0nmol/L、3. 0nmol/L、4.Onmol/L的標(biāo)準(zhǔn)系列。在 400nm激發(fā)波長下QDs-MC-RR生物共輒體的熒光猝滅程度與MC-RR濃度的關(guān)系：該生物共 輒體系的熒光強(qiáng)度與MC-RR濃度在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān)關(guān)系，且符合Lambert-Beer公 式： (F0-Fn) /F0=O. 1103C+0. 02293 (r=0. 99460) F。為未加入MC-RR時QDs-MC-RR生物共輒體的熒光強(qiáng)度；Fn為加入MC-RR后QDs-MC-RR生物共輒體的熒光強(qiáng)度；C為加入MC-RR樣品的濃度(單位：nmol/L)。
[0014] 4、方法精密度及檢出限 按實驗方法對〇. 5nmol/L、2. 0nmol/L、4.Onmol/LMC-RR標(biāo)準(zhǔn)溶液分別平行測定7次， 得出低、中、高M(jìn)C-RR濃度時，本方法的精密度分別為RSD=IL3%、5. 6%、4. 2%。對0. 25nmol/ LMC-RR標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定11次，得到本方法的檢出限達(dá)到2.4X101(]m〇l/L。
[0015] 5、實際樣品的測定及加標(biāo)回收實驗 取水樣用〇. 45Mm超濾膜過濾后加入到QDs-MC-RR生物共輒體中，測其熒光強(qiáng)度的猝 滅，求出水樣中MC-RR的含量，若水樣中MC-RR含量較高，則適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測定。同時，進(jìn) 行了MC-RR低中高三種濃度的加標(biāo)回收實驗，結(jié)果如表1所示： 表1
【主權(quán)項】
1. 一種快捷測定水中MC-RR的量子點(diǎn)熒光檢測方法，其特征在于步驟如下： (1) 制備水溶性核殼式結(jié)構(gòu)的CdSe/CdS量子點(diǎn) 取合成的有機(jī)相CdSe/CdS lmL，用20 y L巰基乙酸轉(zhuǎn)相，正己烷洗滌，干燥，得到CdSe/ CdS量子點(diǎn)QDs粉末；稱取20 mg CdSe/CdS量子點(diǎn)粉末溶于pH= 7. 17的10 mL 0. 02mol/ L的PBS緩沖溶液中，即得到2. Omg/mL水溶性的CdSe/CdS量子點(diǎn)QDs ; (2) 制備QDs-MC-RR生物共輒體及反應(yīng)條件的優(yōu)化 將 2mg EDC、0. 5mg NHS 和 40ML 2. Omg/mL 的 QDs 混合于 2mL 0? 02mol/L pH 為 7. 17 的 PBS緩沖溶液中，混勻后于室溫下孵育30min，加入2ML巰基乙酸終止活化反應(yīng)，5min后向活 化好的QDs溶液中加入IOML 10nmol/L MC-RR單克隆抗體，37°C恒溫震蕩培養(yǎng)lh，加入IOML 0. 04mol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液終止反應(yīng)；再用100KD的超濾膜離心管1000 Orpm離 心純化得到QDs-MC-RR生物共輒體，加入5ML 5%牛血清蛋白溶液封閉； 檢測MC-RR反應(yīng)條件：PBS緩沖溶液pH為7. 17,反應(yīng)時間60min，反應(yīng)溫度37°C，QDs 濃度 2. Omg/mL ; (3) 檢測MC-RR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 向上述2mL QDs-MC-RR生物共輒體溶液中加入10ML不同濃度的MC-RR，分別為 0.0nmol/L、0.5nmol/L、1.0nmol/L、2.0nmol/L、3.0nmol/L、4.0nmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列，在 400nm激發(fā)波長下QDs-MC-RR生物共輒體的熒光猝滅程度與MC-RR濃度的關(guān)系：該生物共 輒體系的熒光強(qiáng)度與MC-RR濃度在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān)關(guān)系，且符合Lambert - Beer公 式： (F0-Fn) /F0=O. 1103C+0. 02293, r=0. 99460 ； F。為未加入MC-RR時QDs-MC-RR生物共輒體的熒光強(qiáng)度；F n為加入MC-RR后QDs-MC-RR 生物共輒體的熒光強(qiáng)度；C為加入MC-RR樣品的濃度，單位：nmol/L ; (4) 方法精密度及檢出限 MC-RR濃度分別為0. 5nmol/L、2. 0nmol/L、4. Onmol/L時平行測定7次，精密度RSD 分別為11. 3%、5. 6%、4. 2% ;MC-RR濃度為0. 25nmol/L時平行測定11次，方法的檢出限為 2. 4X10 10 mol/L〇
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快捷測定水中微囊藻毒素-RR（MC-RR）的量子點(diǎn)熒光檢測方法，屬于分析化學(xué)檢測領(lǐng)域。該方法利用EDC和NHS活化水溶性核殼式CdSe/CdS量子點(diǎn)（QDs）使之與MC-RR單克隆抗體進(jìn)行共價連接，形成QDs-MC-RR生物共軛體。在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下，將不同濃度的MC-RR加入到生物共軛體中，發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，熒光猝滅程度與MC-RR的濃度呈一定相關(guān)。該方法快捷、廉價、簡便且高靈敏度，可直接應(yīng)用于水中MC-RR的測定。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105067582
【申請?zhí)枴緾N201510460434
【發(fā)明人】孟元華, 凌霞, 龔燕, 朱鵬飛, 徐志飛
【申請人】無錫市疾病預(yù)防控制中心
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月31日