用高分辨率質(zhì)譜法量化胰島素樣生長因子-i和胰島素樣生長因子-ii的制作方法
【專利說明】用高分辨率質(zhì)譜法量化胰島素樣生長因子-I和胰島素樣 生長因子-M
[0001] 本申請是分案申請，原申請的申請日為2010年11月4日、申請?zhí)枮?2010800501946 (PCT/US2010/055518)、發(fā)明名稱為"用高分辨率質(zhì)譜法量化胰島素樣生長 因子-I和胰島素樣生長因子-II"。
[0002] 相關(guān)專利申請的交叉引用
[0003] 本申請要求于2009年11月5日提交的美國臨時(shí)申請系列號61/258, 560和于2010 年10月29日提交的美國臨時(shí)申請系列號61/408, 535的優(yōu)先權(quán)，其通過參考以其包括所有 圖和表的整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及使用質(zhì)譜法定量分析大的蛋白質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0005] IGF-I是具有與胰島素類似的分子結(jié)構(gòu)的激素。它是由肝產(chǎn)生的肽并在具有三個(gè) 分子內(nèi)二硫鍵的單鏈中包含70個(gè)氨基酸。IGF-I的分子量為約7, 649Da，并且在血清中是 高度蛋白結(jié)合的。通過生長激素刺激產(chǎn)生并可由于營養(yǎng)不足、生長激素不敏感性、缺乏生長 激素受體或下游信號傳導(dǎo)途徑故障而阻止產(chǎn)生。IGF-I在兒童生長中起重要的作用并在成 人中持續(xù)具有合成代謝作用。
[0006] 胰島素樣生長因子II(IGF-II)也是具有與胰島素類似的分子結(jié)構(gòu)的激素。它是 包含67個(gè)氨基酸的單鏈肽。IGF-II分子量為約7, 50?a，并且在血清中是高度蛋白結(jié)合 的。IGF-II在與生長激素相關(guān)病癥的臨床評估中用作胰島素樣生長因子I(IGF-I)的輔助 物（adjunct)。IGF-II通過與IGF-I和不同細(xì)胞表面受體相互作用并使結(jié)合蛋白循環(huán)以調(diào) 節(jié)組織生長，主要在胎兒生長和發(fā)育中起作用。由于生長激素缺乏或營養(yǎng)不良，IGF-II在 兒童和成人中的水平降低。在肢端巨大癥或IGF-I的外源給藥可觀察到增加的IGF-II血 清水平。因此，測量循環(huán)的IGF-II水平（即血漿/血清中）是控制數(shù)種生長激素相關(guān)病癥 的重要工具。另外，在各種流行病學(xué)研究領(lǐng)域和臨床試驗(yàn)中測量循環(huán)IGF-II也是有價(jià)值的 工具。
[0007] 已經(jīng)證實(shí)用"顛倒（bottmomup)"方法（S卩，酶消化和量化一種或多種所得肽） 量化分析IGF-I和IGF-II尤其是有挑戰(zhàn)性的。例如，deKock等報(bào)道典型的胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶和胃蛋白酶消化方法產(chǎn)生低的消化產(chǎn)量和非特異性酶卵裂。deKock等，Rapid Commun.MassSpectrom. ,2001,15:1191-97。deKock等建議，不令人滿意的消化結(jié)果可能 是因?yàn)橛蒊GF-I的三個(gè)二硫鍵造成的蛋白水解酶的空間限制性。Id。
[0008] 已經(jīng)努力開發(fā)分析IGF-I和IGF-II的方法，包括通過各種質(zhì)譜技術(shù)。例如，已經(jīng) 報(bào)道了使用具有單離子監(jiān)測（S頂）的LC-離子阱MS分析IGF-I。見，例如Id. ;Bobin等， Analyst，2001, 126:1996-2001 ;和Popot等，Chromatographia, 2001，54:737-741(Popot I)。這些參考文獻(xiàn)公開了S頂模式中電荷狀態(tài)范圍為4+至9+的完整IGF-I的LC-ESI-離 子阱MS。最近，已經(jīng)公開了使用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM)的LC-MS/MS技術(shù)。PopotII報(bào)道使用 具有S頂?shù)腖C-離子阱MS定量分析電荷狀態(tài)范圍為4+至9+的IGF-I，隨后用LC-離子阱 MS/MS使用MRM定性確認(rèn)分析物。Popot等AnalBioanalChem, 2008, 390:1843-52(Popot II)。MRM實(shí)驗(yàn)使用所選擇的多電荷IGF-I離子（7+和8+)作為裂解實(shí)驗(yàn)中的前體離子。 Bredehdft等報(bào)道使用軌道阱質(zhì)譜儀器定性測定IGF-I前體和產(chǎn)物離子的質(zhì)荷比，并使 用確定的離子使用LC-三重四極桿MS/MS用于隨后的IGF-I定量。Bredehdft等Rapid Commun.MassSpectrom.，2008, 22:477-485〇
[0009] 類似地，已經(jīng)報(bào)道了使用酶消化隨后質(zhì)譜分析消化產(chǎn)物來分析 IGF-II。見，例如Smith等，J.Biol.Chem.，1989, 16:9314-9321 ;和Bayne等 P印tideResearch, 1990,6:271-273。已經(jīng)報(bào)道了用于分析完整IGF-II質(zhì)譜 檢測的其他研究。見，例如，Hampton等J.Biol.Chem.，1989,32:19155-19160 ; Hayne等J.Chromatog. 1991，52:391-402;Wadensten等Biotech,andApp. Biochem. ,1991,13:412-421;Jespersen等J.MassSpectrom. ,1996,31:893-900;和 Nelson等J.Proteome, 2004, 3:851-855。這些參考文獻(xiàn)報(bào)道用等離子體脫附和MALDI-TOF 質(zhì)譜技術(shù)檢測完整的IGF-II。Hampton等檢測范圍從1+至3+的電荷狀態(tài)。除了Hampton 等之外都檢測到1+電荷狀態(tài)的IGF-II。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本文描述的方法是用高分辨率/高準(zhǔn)確度質(zhì)譜法質(zhì)譜測定樣品中胰島素樣生長 因子I(IGF-I)蛋白和/或胰島素樣生長因子II(IGF-II)蛋白的量。該方法具有簡化的預(yù) 分析步驟，其僅僅任選地包括蛋白質(zhì)裂解、消化和/或檢測蛋白質(zhì)片段。優(yōu)選地，樣品收集 后不進(jìn)行一種或多種完整蛋白的裂解或消化。
[0011] 在本發(fā)明的第一方面，通過質(zhì)譜法測定樣品中IGF-I蛋白或其片段的量，所述質(zhì) 譜法包括使來自樣品的IGF-I蛋白或其片段在適合產(chǎn)生質(zhì)譜法可檢測的一種或多種IGF-I 離子的條件下電離；和通過高分辨率/高準(zhǔn)確度質(zhì)譜法測定一種或多種IGF-I離子的量。 所測定的一種或多種IGF-I離子的量與樣品中IGF-I蛋白或其片段的量相關(guān)。在一些實(shí)施 方式中，IGF-I蛋白或其片段源于樣品。在一些實(shí)施方式中，IGF-I蛋白或其片段是完整的 長R3IGF-I或其片段。在一些實(shí)施方式中，IGF-I蛋白是完整的長R3IGF-I。
[0012] 第二方面，通過質(zhì)譜法測定樣品中IGF-II蛋白或其片段的量，所述質(zhì)譜法包括將 樣品中的IGF-II蛋白或其片段在適合產(chǎn)生質(zhì)譜法可檢測的一種或多種IGF-II離子的條件 下電離；和通過高分辨率/高準(zhǔn)確度質(zhì)譜法測定一種或多種IGF-II離子的量。所測定的一 種或多種IGF-II離子的量與樣品中IGF-II蛋白或其片段的量相關(guān)。優(yōu)選地，IGF-II蛋白 源于樣品并且是完整的。
[0013] 第三方面，IGF-I蛋白或其片段和IGF-II蛋白或其片段的量通過質(zhì)譜法同時(shí)測 定，所述質(zhì)譜法包括將來自樣品的IGF-I蛋白或其片段和IGF-II蛋白或其片段在適合產(chǎn)生 質(zhì)譜法可檢測的一種或多種IGF-I離子和一種或多種IGF-II離子的條件下電離；和通過高 分辨率/高準(zhǔn)確度質(zhì)譜法測定一種或多種IGF-I離子和一種或多種IGF-II離子的量。所 測定的IGF-I和IGF-II離子的量與樣品中IGF-I和IGF-II蛋白或其片段的量相關(guān)。優(yōu)選 地，IGF-I和IGF-II蛋白源于樣品并且是完整的。
[0014] 在一些實(shí)施方式中，樣品可在電離之前通過固相提?。⊿PE)純化。在一些實(shí)施方 式中，樣品可在電離之前通過高效液相色譜法（HPLC)純化。在相關(guān)實(shí)施方式中，樣品可在 電離之前用SPE和HPLC兩者純化，并且純化可任選地用聯(lián)機(jī)處理進(jìn)行。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，高分辨率/高準(zhǔn)確度質(zhì)譜法用大于或等于約10, 000的分辨本 領(lǐng)（FWHM)進(jìn)行，如大于或等于約15, 000,如大于或等于約20, 000,如大于或等于約25, 000。 在一些實(shí)施方式中，高分辨率/高準(zhǔn)確度質(zhì)譜法以小于或等于約50ppm的準(zhǔn)確度進(jìn)行，如小 于或等于約20ppm，如小于或等于約lOppm，如小于或等于約5ppm;如小于或等于約3ppm。 在一些實(shí)施方式中，高分辨率/高準(zhǔn)確度質(zhì)譜法以大于或等于約10, 〇〇〇的分辨本領(lǐng)（FWHM) 和小于或等于約50ppm的準(zhǔn)確度進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，分辨本領(lǐng)大于約15, 000并且 準(zhǔn)確度小于或等于約20ppm。在一些實(shí)施方式中，分辨本領(lǐng)大于或等于約20, 000并且準(zhǔn)確 度小于或等于約IOppm;優(yōu)選地分辨本領(lǐng)大于或等于約25, 000并且準(zhǔn)確度小于或等于約 5ppm，如小于或等于約3ppm。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，高分辨率/高準(zhǔn)確度質(zhì)譜法可用軌道阱質(zhì)譜儀、飛行時(shí)間 (TOF)質(zhì)譜儀或傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（有時(shí)候稱為傅里葉變換質(zhì)譜儀）進(jìn)行。 在一些實(shí)施方式中，樣品可包括生物學(xué)樣品；優(yōu)選血漿或血清。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，通過質(zhì)譜法可檢測的一種或多種IGF-I離子是選自m/z在 850. 8±2、957. 1±2、1093. 7±2和1275. 8±2范圍內(nèi)的離子的一種或多種離子。這些范圍 內(nèi)的離子分別對應(yīng)于電荷為9+、8+、7+和6+的IGF-I離子，并主要落在所述的m/z值± 1的 范圍內(nèi)。優(yōu)選地一種或多種IGF-I離子包括選自m/z在957. 1 ±2和1093. 7±2范圍內(nèi)的 IGF-I離子的一種或多種離子。1093. 7±2范圍內(nèi)IGF-I離子優(yōu)選地包括選自具有下列m/ z的IGF-I離子的一種或多種IGF-I離子：約 1091. 94±0. 1、1092. 80±0. 1、1092. 94±0. 1、 109 3. 09 + 0.Ul093. 23 + 0.Ul093. 37 + 0.Ul093. 52 + 0.Ul093. 66 + 0.U 109 3. 80 + 0.U1093. 95 + 0.U1094. 09 + 0.U1094. 23 + 0.Ul094. 38 + 0.U 1094. 52±0. 1、1094. 66±0. 1和1095. 37±0. 1。在一些實(shí)施方式中，使通過質(zhì)譜法檢測的 一種或多種IGF-I離子的量與樣品中IGF-I蛋白的量相關(guān)聯(lián)包括與內(nèi)標(biāo)比較；如人IGF-I 蛋白或非人IGF-I蛋白（例如，完整重組小鼠重組小鼠IGF-I)。內(nèi)標(biāo)可任選地被同位素標(biāo) 記。
[0018] 在一些實(shí)施方式中，質(zhì)譜法可檢測的一種或多種IGF-II離子是選自具有下列m/ z范圍的IGF-II離子的一種或多種IGF-II離子：約 934. 69±2、1068. 07±2、1245. 92±2 和1494. 89±2。這些范圍內(nèi)的離子分別對應(yīng)于具有電荷8+、7+、6+和5+的IGF-II離子， 并且主要落在所述的m/z值±1的范圍內(nèi)。優(yōu)選地一種或多種IGF-II離子包括選自具有 下列m/z的IGF-II離子的IGF-II離子：約 1067. 36±0. 1、1067. 51±0. 1、1067. 65±0. 1、 106 7. 80 + 0.Ul067. 94 + 0.Ul068. 08 + 0.Ul068. 23 + 0.Ul068. 37 + 0.U 1068. 51±0. 1、1068. 65±0. 1、1068. 80±0. 1、1068. 94±0. 1 和 1069. 08±0. 1 ;優(yōu)選地，一 種或多種IGF-II離子選自具有下列m/z的離子：約1067. 94±0. 1和1068. 08±0. 1。在 一些實(shí)施方式中，使通過質(zhì)譜法檢測的一種或多種IGF-II離子的量與樣品中IGF-II蛋白 的量相關(guān)聯(lián)包括與內(nèi)標(biāo)比較；如人IGF-II蛋白或非人IGF-II蛋白（例如，完整重組小鼠 IGF-II)〇
[0019] 在一些實(shí)施方式中，樣品中天然完整IGF-I和/或IGF-II的量通過質(zhì)譜法測定， 所述質(zhì)譜法包括使完整的源于樣品并通過固相提取（SPE)和高效液相色譜法（HPLC)純化 的IGF-I和/或IGF-II，在適合產(chǎn)生質(zhì)譜法可檢測的一種或多種IGF-I和/或IGF-II離子 的條件下電離。如果天然完整IGF-I的量被測定，一種或多種IGF-I離子包括選自具有下 列范圍內(nèi)m/z的IGF-I離子的一種或多種IGF-I離子：約850. 8±2、957. 1±2、1093. 7±2 和1275. 8±2。如果天然完整IGF-II的量被測定，一種或多種IGF-II離子包括選自具有 下列范圍內(nèi)m/z的IGF-II尚子的一種或多種IGF-II尚子：約934. 69±2、1068. 07±2、 1245. 92±2和1494. 89±2。再一次，對于IGF-I和IGF-II，上述范圍內(nèi)的離子主要落在所 述的m/z值± 1的范圍內(nèi)。一種或多種IGF-I和/或IGF-II離子接著通過高分辨率/高 準(zhǔn)確度質(zhì)譜法測定；其中一種或多種IGF-I和/或IGF-II離子的量用于測定樣品中天然完 整IGF-I和/或IGF-II的量。在這些實(shí)施方式中，高分辨率/高準(zhǔn)確度質(zhì)譜法用軌道阱或 TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行，并且SPE和HPLC可以以聯(lián)機(jī)方式進(jìn)行。
[0020] 上面列出的實(shí)施方式的特征可以沒有限制地在本發(fā)明的方法中結(jié)合使用。
[0021] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，質(zhì)譜法以陽離子模式進(jìn)行?？蛇x地，質(zhì)譜法以陰離子模 式進(jìn)行。本文描述的方法中使用的優(yōu)選的電離技術(shù)是電噴霧電離（ESI)。電噴霧電離可以 例如用熱的電離源進(jìn)行。
[0022] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種或多種分別可檢測的內(nèi)標(biāo)提供在樣品中，其在樣品中 的量也被測定。在這些實(shí)施方式中，兩種關(guān)注的分析物和一種或多種內(nèi)標(biāo)的所有或部分 被電離以產(chǎn)生多個(gè)質(zhì)譜儀可檢測的離子，并且通過質(zhì)譜法檢測從每種物質(zhì)產(chǎn)生的一種或 多種離子。內(nèi)標(biāo)可選自完整的非人IGF-I(例如，同位素標(biāo)記的或未標(biāo)記的完整重組小鼠 IGF-I)、同位素標(biāo)記的完整人IGF-I蛋白、完整的非人IGF-II蛋白（例如，同位素標(biāo)記的或 未標(biāo)記的完整重組小鼠IGF-II)和同位素標(biāo)記的完整人IGF-II蛋白。
[0023] 在其他實(shí)施方式中，樣品中完整的IGF-I和/或IGF-II蛋白的量可通過與一種或 多種外部參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較而被測定。示例性外部參考標(biāo)準(zhǔn)包括用同位素標(biāo)記的或未標(biāo)記 的、完整人或非人IGF-I和/或IGF-II蛋白（例如，同位素標(biāo)記的或未標(biāo)記的完整重組小 鼠IGF-I和或IGF-II)摻入的空白血漿或血清。
[0024] 在一些實(shí)施方式中，包括來自兩種或多種分子同位素形式的分析物的質(zhì)譜峰的同 位素"簽字"可用于確認(rèn)被研究分析物的同一性。在其他實(shí)施方式中，來自一種或多種同位 素形式的質(zhì)譜峰可用于量化關(guān)注的分析物。在一些相關(guān)實(shí)施方式中，來自一種同位素形式 的單個(gè)質(zhì)譜峰可用于量化感興趣的分析物。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，多個(gè)同位素峰可用于 量化分析物。多個(gè)峰可經(jīng)歷任何合適的數(shù)學(xué)處理。數(shù)種數(shù)學(xué)處理是本領(lǐng)域已知的，包括但 不限于對多重峰下面積的求和，或平均多重峰的響應(yīng)。
[0025] 如本文所使用，除非另外指出，單數(shù)形式"一個(gè)（a)"、"一個(gè)（an)"和"所述"包括 復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提及"蛋白質(zhì)"包括多個(gè)蛋白質(zhì)分子。
[0026] 如本文所使用，術(shù)語"IGF-I蛋白"指全長IGF-I多肽或其片段，以及全長IGF-I 變體的多肽或其片段。IGF-I變體包括，例如長R3IGF-I，其是IGF-I的83個(gè)氨基酸的類似 物，其包括完全的人IGF-I序列--在3位（因此R3)具有Arg(R)對Glu(E)的取代，和在 N末端的13個(gè)氨基酸延伸肽（extensionpeptide)。為了提高IGF-I肽的生物活性，已經(jīng) 生產(chǎn)了IGF-I的該類似物。該類似物的質(zhì)量為約9111. 4道爾頓，因此多電荷長R3IGF-I離 子可觀察到具有的m/z比為約1014. 1±1、1140. 7±1、1303. 5±1和1520. 6±1。本領(lǐng)域技 術(shù)人員容易理解其他IGF-I變體多肽，包括例如已經(jīng)被化學(xué)改性的全長IGF-I多肽或其片 段。示例性化學(xué)改性可包括