一種基于聚多巴胺修飾的光纖spr傳感器表面連接抗體方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于聚多巴胺修飾的光纖SPR傳感器表面連接抗體方法，屬于表面等離子共振譜儀傳感器表面修飾與功能分子連接方法。
技術(shù)背景
[0002]光纖型表面等離子共振(Surface plasmon resonance, SPR)傳感器，用于監(jiān)測分子相互作用與目標(biāo)分子定量檢測，已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、DNA雜交與細(xì)胞行為監(jiān)測、環(huán)境與食品安全檢測等領(lǐng)域。它不但保持了傳統(tǒng)棱鏡型SPR傳感器高靈敏度、無標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測等特點(diǎn)，并且具有其獨(dú)特優(yōu)勢，包括:小型化、可抵抗電磁波干擾、可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳感等。
[0003]抗體在傳感器表面的連接效率，對SPR免疫分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果起著關(guān)鍵作用。傳感器上連接越多的抗體，就能檢測到越多的抗原。目前，SPR傳感器連接抗體方法主要是利用抗體中的氨基與11-巰基十一烷酸修飾的傳感器上的羧基之間的反應(yīng)，從而將抗體連接至傳感器表面。然而，由于該方法在抗體連接前，需要用1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)對傳感器表面的羧基進(jìn)行活化，而此活化過程存在著嚴(yán)重的水解現(xiàn)象，從而導(dǎo)致了此方法連接抗體效率大大降低。因此，開發(fā)有效的連接抗體方法，提高抗體連接效率和抗原檢測靈敏度，成為專家學(xué)者們亟待解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種基于聚多巴胺修飾的光纖SPR傳感器表面連接抗體方法。該連接抗體方法快速、簡便，具有優(yōu)異的抗體連接效率以及賦予傳感器高的抗原檢測靈敏度。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的。
[0005]本發(fā)明的一種基于聚多巴胺修飾的光纖SPR傳感器表面連接抗體方法，包括以下步驟:
[0006]I)稱取多巴胺鹽酸鹽，將其溶于1mM的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，配制成
l-2mg/mL的多巴胺溶液；將清洗過的傳感器浸泡于配置的多巴胺溶液中，于振蕩器中反應(yīng)20-50min，用去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈桑玫骄鄱喟桶沸揎椀膫鞲衅鳎?br>[0007]2)將步驟I)制備的聚多巴胺修飾的傳感器浸泡于50-100 μ g/mL的抗體的PBS中，SPR譜儀實(shí)時(shí)監(jiān)測傳感器共振波長變化，3-5h后，傳感器表面連接抗體反應(yīng)初步達(dá)到平衡；為使傳感器表面連接抗體更加牢固和充分，將此連接抗體反應(yīng)轉(zhuǎn)移到4°C的恒溫箱中繼續(xù)反應(yīng)過夜，然后取出，PBS清洗，氮?dú)獯蹈伞?br>[0008]所述的PBS 濃度為 10mM，pH = 7.4。
[0009]所述步驟I)中，振蕩器轉(zhuǎn)速需為120轉(zhuǎn)每分鐘。
[0010]所述步驟2)中，抗體為帶氨基或巰基的其它抗體。
[0011]所述抗體為抗人免疫球蛋白G、牛血清白蛋白抗體或前列腺炎抗體。
[0012]本發(fā)明的連接抗體方法用于棱鏡型SPR傳感器與QCM傳感器。
[0013]本發(fā)明的光纖SPR傳感器連接抗體方法，到目前為止是沒有人報(bào)道過的；為了進(jìn)一步評價(jià)本發(fā)明方法的連接抗體效果，我們采用傳統(tǒng)的連接抗體方法(抗體中的氨基與
11-巰基十一烷酸修飾的傳感器上的羧基之間的反應(yīng))作為對比實(shí)驗(yàn)，對本發(fā)明方法與傳統(tǒng)方法的連接抗體與檢測抗原效果進(jìn)行了比較，驗(yàn)證本發(fā)明方法具有高的抗體連接效率和抗原檢測靈敏度。
[0014]本發(fā)明通過多巴胺在金膜表面快速簡便的自發(fā)聚合，形成聚多巴胺修飾的金膜表面；通過金膜表面聚多巴胺中醌基與抗體中氨基的席夫堿反應(yīng)，抗體被連接在聚多巴胺修飾的金膜表面?？疾炝司鄱喟桶沸揎椀膫鞲衅鬟B接抗體以及檢測抗原效果，結(jié)果顯示:利用本發(fā)明方法連接抗體后，傳感器共振波長偏移量約為傳統(tǒng)方法的2倍；對抗原檢測的靈敏度約為傳統(tǒng)連接抗體方法的4倍，檢測限比傳統(tǒng)連接抗體方法約低7倍。本發(fā)明的連接抗體方法，擁有優(yōu)異的抗體連接效率與高的抗原檢測靈敏度，且方法簡單、快速，具有很好的經(jīng)濟(jì)適用性和可行性。與現(xiàn)有SPR傳感器連接抗體方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0015](I)本發(fā)明方法中，傳感器可以通過多巴胺的自身聚合被有效的功能化，該功能化操作簡單、反應(yīng)迅速。
[0016](2)本發(fā)明方法，比傳統(tǒng)的連接抗體方法有更高的抗體連接效率，見附圖1 ;對抗原檢測，有更高的靈敏度，見附圖2。
[0017](3)本發(fā)明方法中的傳感器表面的聚多巴胺層，可以在強(qiáng)氧化性溶劑中快速解聚，從傳感器表面去除，所以利用本發(fā)明方法進(jìn)行抗體連接或免疫實(shí)驗(yàn)后，可迅速簡便的實(shí)現(xiàn)傳感器再生。
【附圖說明】
[0018]圖1本發(fā)明方法(抗體中氨基與聚多巴胺修飾的傳感器中醌基反應(yīng))與傳統(tǒng)方法(抗體中氨基與11-巰基十一烷酸修飾的傳感器中羧基反應(yīng))連接抗體動力學(xué)曲線。
[0019]圖2本發(fā)明方法(抗體中氨基與聚多巴胺修飾的傳感器中醌基反應(yīng))與傳統(tǒng)方法(抗體中氨基與11-巰基十一烷酸修飾的傳感器中羧基反應(yīng))連接抗體后，對抗原的檢測能力對比。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1
[0021 ] 將SPR傳感器用乙醇、水清洗，氮?dú)獯蹈?，備用。稱取多巴胺鹽酸鹽，將其溶于1mM的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，配制成2mg/mL的多巴胺溶液。將清洗過的傳感器浸泡于配置的多巴胺溶液中，于振蕩器中(120轉(zhuǎn)每分鐘)反應(yīng)30min，取出，用去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?，金膜表面被聚多巴胺功能化。將聚多巴胺修飾的傳感器通過SMA等接頭連接到光纖SPR譜儀上，然后，將其浸泡于100 μ g/mL的羊抗人免疫球蛋白G的PBS中，光纖SPR譜儀實(shí)時(shí)監(jiān)測聚多巴胺修飾的傳感器共振波長變化，每隔一定的時(shí)間疊加一次活動光譜，記錄該時(shí)刻下傳感器的共振波長。用origin軟件作圖，得到聚多巴胺修飾的SPR傳感器對羊抗人免疫球蛋白G的動力學(xué)吸附曲線(見附圖1)。
[0022]對比實(shí)驗(yàn):將SPR傳感器用乙醇、水清洗，氮?dú)獯蹈?，浸入ImM的11_巰基^^一烷酸乙醇溶液中，室溫反應(yīng)12h，取出，乙醇沖洗，氮?dú)獯蹈?。修飾后的傳感器，浸?-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(0.4mM/0.1mM)的混合液中30min，活化11-巰基^^一烷酸修飾的傳感器表面上的羧基，取出，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?。?1-巰基i^一烷酸修飾的傳感器通過SMA等接頭連接到光纖SPR譜儀上，然后，將其浸泡于lOOyg/mL的羊抗人免疫球蛋白G的PBS中，與聚多巴胺修飾的傳感器同樣的監(jiān)測方法與數(shù)據(jù)處理，得到11-巰基i^一烷酸修飾的SPR傳感器對羊抗人免疫球蛋白G的動力學(xué)吸附曲線(見附圖1)。
[0023]圖中顯示:在連接羊抗人免疫球蛋白G抗體實(shí)驗(yàn)達(dá)到平衡時(shí)，聚多巴胺修飾的SPR傳感器波長偏移約為11-巰基i^一烷酸修飾的SPR傳感器波長偏移的2倍，且從曲線斜率得知:聚多巴胺修飾的SPR傳感器連接抗體速度遠(yuǎn)快于11-巰基^^一烷酸修飾的SPR傳感器連接抗體速度。該結(jié)果表明:與傳統(tǒng)連接抗體方法相比，本發(fā)明方法(抗體中氨基與聚多巴胺修飾的傳感器中醌基反應(yīng))擁有更好的抗體連接效率。
[0024]實(shí)施例2