作為用于預(yù)防重量增加的益生元功效的生物標(biāo)記物的α-酮-異戊酸的制作方法
【專利說明】作為用于預(yù)防重量增加的益生元功效的生物標(biāo)記物的 a-酮-異戊酸 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明一般涉及營養(yǎng)和健康的領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及用于預(yù)測和/或量化受 試者對益生元在預(yù)防膳食誘導(dǎo)的重量增加中的響應(yīng)的方法、以及可用于此類方法的生物標(biāo) 記物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 肥胖癥是主要的公共健康問題，因為其增強罹患日益流行的數(shù)種慢性疾病的風(fēng) 險。肥胖癥起因于能量攝取和消耗之間的不平衡，與慢性低級炎癥相關(guān)。已知有助于發(fā)展 2型糖尿病（T2DM)、非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD)、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎和心血管疾?。–VD)的 風(fēng)險。肥胖癥起因于遺傳因素和環(huán)境因素如高熱量膳食和缺少身體活動之間的復(fù)雜相互作 用，最近的研究也已表明腸道微生物群可在發(fā)展肥胖癥中起作用。失衡的富含脂肪和/或 碳水化合物的膳食與脂肪組織、肌肉、肝臟和心臟中的三甘油酯貯存相關(guān)。異位脂肪沉積、 特別是在中央分布中的異位脂肪沉積也被認(rèn)為促成一系列代謝病癥如高甘油三酯血癥、高 血壓、高空腹葡萄糖和胰島素抵抗（IR)。
[0004] 腸道微生物被認(rèn)為通過影響代謝和免疫宿主功能而有助于體重調(diào)控和相關(guān)病癥。 總的來說，腸道微生物群改善宿主提取和貯存來自膳食的能量、從而導(dǎo)致體重增加的能力， 同時具體的共生微生物似乎對膽汁鹽、脂蛋白和膽固醇代謝發(fā)揮有益效應(yīng)。腸道微生物群 和一些益生菌也調(diào)控免疫功能，保護(hù)宿主免受感染和慢性炎癥。相比之下，生態(tài)失調(diào)和內(nèi)毒 素血癥可以是炎癥性因子，其是發(fā)展胰島素抵抗和體重增加的原因。按照腸道微生物群、代 謝和免疫之間的聯(lián)系，使用膳食策略調(diào)控微生物群組成可能在控制代謝病癥方面有效。盡 管迄今為止僅一些臨床前和臨床試驗已表明具體的腸道微生物和益生元對這些病癥的生 物學(xué)標(biāo)記物的效應(yīng)，但是這些發(fā)現(xiàn)指示這一領(lǐng)域的進(jìn)展可能在針對肥胖癥及其相關(guān)代謝病 癥的斗爭中具有價值（Sanz等人2008)。
[0005] 來自實驗?zāi)Ｐ秃腿梭w研究的最近數(shù)據(jù)支持了具有益生元性質(zhì)的特定食品對能量 穩(wěn)態(tài)、飽腹感調(diào)控和體重增加的有益效應(yīng)。與肥胖動物和患者中的數(shù)據(jù)一起，這些研究支持 以下假設(shè)：腸道微生物群組成（尤其是雙歧桿菌屬的數(shù)量）可有助于調(diào)控與X綜合征、尤其 是肥胖癥和2型糖尿病相關(guān)的代謝過程。這些效應(yīng)與微生物群-誘導(dǎo)的變化相關(guān)是有道理 的，即使不是唯一的，并且得出它們的機(jī)制符合益生元效應(yīng)的結(jié)論是可行的。然而，這些健 康益處的此類變化的作用仍有待明確證實。作為在15年前益生元概念公布之后的研究活 動的結(jié)果，已變得清楚的是，引起腸道微生物群的組成和/或活性的選擇性變化、由此加強 正常生態(tài)（normobiosis)的產(chǎn)品，可誘導(dǎo)結(jié)腸中以及也在腸外隔室中的有益生理效應(yīng)，或 有助于減少生態(tài)失調(diào)以及相關(guān)腸和系統(tǒng)性病理學(xué)的風(fēng)險（Roberfroid等人，2010)。
[0006] 因此，希望提供本領(lǐng)域一種允許其早期鑒定增加重量-理想地處于增加重量風(fēng) 險-的受試者的方法（例如如在啟動重量減輕程序后）。特別地，希望提供一種用于預(yù)測 和/或量化受試者對益生元在預(yù)防膳食誘導(dǎo)的重量增加中的響應(yīng)的方法，尤其是在開始施 用益生元后的早期階段。
[0007] 因此，本發(fā)明的目的是提供：根據(jù)它們是否可能對基于益生元的干預(yù)作出反應(yīng)以 預(yù)防高脂肪膳食誘導(dǎo)的或相關(guān)的重量增加，而允許對受試者早期分層的方法。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 因此，本發(fā)明提供一種用于預(yù)測和/或量化受試者對益生元在預(yù)防膳食誘導(dǎo) 的重量增加中的響應(yīng)的方法，其包括確定在獲自已食用益生元的受試者的尿樣品中的 a-酮-異戊酸（a-keto-isovalerate)的水平，并將受試者的a-酮-異戊酸水平與預(yù)定 參照值比較，其中與預(yù)定參照值比較，尿樣品中的a-酮-異戊酸水平減少或a-酮-異戊 酸水平?jīng)]有變化，指示益生元的施用在預(yù)防受試者中膳食誘導(dǎo)的重量增加中有效。
[0010] 在一個實施方案中，該膳食為高脂肪膳食。
[0011] 在一個實施方案中，該方法還包括以下步驟：
[0012] a)確定尿樣品中至少一種選自以下的其他生物標(biāo)記物的水平：草酰乙酸 (oxaloacetate)、肌酸酐、三甲胺和硫酸D引噪酸（indoxylsulfate)，以及
[0013] b)將受試者的至少一種其他生物標(biāo)記物的水平與預(yù)定參照值比較，
[0014] 其中：與預(yù)定參照值比較，
[0015] i)尿樣品中草酰乙酸、肌酸酐和/或硫酸吲哚酚水平減少，或草酰乙酸、肌酸酐和 /或硫酸吲哚酚水平?jīng)]有變化；和/或
[0016] ii)尿樣品中三甲胺水平增加，或三甲胺水平?jīng)]有變化；
[0017] 指示益生元的施用將在預(yù)防受試者中膳食誘導(dǎo)的重量增加中有效。
[0018] 在一個實施方案中，尿樣品中的生物標(biāo)記物的水平通過1H-NMR和/或質(zhì)譜法來確 定。
[0019] 在一個實施方案中，預(yù)定參照值是基于在食用高脂肪膳食的受試者的對照群體中 的尿中平均a-酮-異戊酸水平。在另一個實施方案中，預(yù)定參照值是在食用益生元前受 試者的尿中a-酮-異戊酸水平。
[0020] 在一個實施方案中，在至少連續(xù)三天食用益生元后，確定獲自受試者的尿樣品中 的a-酮-異戊酸和/或其他生物標(biāo)記物的水平。優(yōu)選受試者這段時間已經(jīng)食用至少2g/ 天的量的益生元或更長時間。
[0021] 在一個實施方案中，益生元選自下組：低聚糖，任選地含有果糖、半乳糖、甘露 糖；膳食纖維，特別地可溶性纖維、大豆纖維；菊粉；或其混合物。優(yōu)選益生元選自下 組：低聚果糖（FOS);低聚半乳糖（GOS);低聚異麥芽糖；低聚木糖；牛乳低聚糖（bovine milkoligosaccharides,BM0S);糖基鹿糖（glycosylsucrose)，GS);低聚乳果糖 (lactosucrose，LS);乳果糖（LA);低聚帕拉金糖（palatinose-oligosaccharides，PA0); 低聚麥芽糖（MOS);樹膠和/或其水解物；果膠和/或其水解物；及其組合。
[0022] 在一個優(yōu)選實施方案中，益生元包含低聚半乳糖（G0S)。在另一個優(yōu)選 實施方案中，益生元包含牛乳低聚糖（BMOS)，更優(yōu)選奶牛乳低聚糖（cow'smiIk oligosaccharides)-半乳低聚糖（CM0S-G0S)。在另一個優(yōu)選實施方案中，益生元包含菊粉 和低聚果糖（FOS)。
[0023] 在一些實施方案中，受試者為哺乳動物如人；非人物種，包括靈長類；家畜動物如 綿羊、奶牛、豬、馬、驢或山羊；實驗室試驗動物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠或倉鼠；或陪伴動物 如狗或貓。
[0024] 在一個實施方案中，該方法用于設(shè)計用于一組受試者的分層膳食或用于該受試者 的個性化膳食。
[0025] 另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防受試者中膳食誘導(dǎo)的重量增加的方法，其包括：
[0026]a)執(zhí)行如上所述的方法；以及
[0027]b)如果尿樣品中a-酮-異戊酸的水平相較于預(yù)定參照值減少或未改變，則向受 試者施用益生元。
[0028] 在一個實施方案中，向受試者施用益生元持續(xù)至少一個月。
[0029] 在一個實施方案中，如果尿樣品中a_酮-異戊酸的水平相較于預(yù)定參照樣品增 加，則不向受試者施用益生元。優(yōu)選向受試者提供用于重量增加預(yù)防的替代治療，所述治療 選自熱量限制、膳食脂肪攝取減少、非益生元重量減輕產(chǎn)品或鍛煉計劃。
[0030] 另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)測和/或量化受試者對益生元在預(yù)防膳食誘導(dǎo)的重 量增加中的響應(yīng)的尿中生物標(biāo)記物，其中生物標(biāo)記物為a-酮-異戊酸。
[0031] 另一方面，本發(fā)明提供a_酮-異戊酸作為尿中生物標(biāo)記物用于預(yù)測和/或量化 受試者對益生元在預(yù)防膳食誘導(dǎo)的重量增加中的響應(yīng)的用途。
[0032] 附圖簡述
[0033] 圖1 :描述動物的體重曲線。
[0034] 圖2:具有對益生元的具體響應(yīng)且涉及重量增加的代謝物的依時性曲線。A:對照； B:高脂肪對照，C:高脂肪GOS;D:高脂肪G0SCM0S，E:高脂肪Prebiol，F(xiàn):高脂肪糖。垂直 軸對應(yīng)于由峰面積積分獲得的代謝物中的相對濃度，數(shù)據(jù)以曲線下面積（AUC)給出。
[0035] 圖3:具有對益生元的具體響應(yīng)且涉及重量增加的代謝物的依時性曲線。TMA，三 甲胺；TMA0,三甲胺-N-氧化物。A:對照；B:高脂肪對照，C:高脂肪GOS;D:高脂肪G0SCM0S， E:高脂肪Prebiol，F(xiàn):高脂肪糖。垂直軸對應(yīng)于由峰面積積分獲得的代謝物中的相對濃度， 數(shù)據(jù)以曲線下面積（AUC)給出。
[0036] 發(fā)明詳沐
[0037] 本發(fā)明人已使用代謝組學(xué)（metabonomics)方法來實現(xiàn)本發(fā)明的目的。代謝組學(xué) 用于表征代謝表型，其包含各種因素如環(huán)境、藥物、膳食、生活方式、遺傳學(xué)和微生物組學(xué)因 素的影響。與指示潛在生理變化的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)不同，代謝物及其在細(xì)胞、組織 和器官內(nèi)的動態(tài)濃度變化表示生理調(diào)控過程的實際終點。
[0038] 因此，研究與各種膳食干預(yù)和疾病發(fā)展相關(guān)的逐步代謝變化是適合的方法。近來， 基于代謝物組學(xué)（metabolomics)和脂類組學(xué)的發(fā)現(xiàn)已加速我們對疾病過程的理解，將提 供用于預(yù)防和營養(yǎng)管理與代謝綜合征相關(guān)的亞臨床病癥的新途徑。特別地，"組學(xué)"數(shù)據(jù)已 突出能量代謝（Krebs循環(huán)）、脂質(zhì)和氨基酸加工、以及炎癥信號對肥胖癥和IR發(fā)作的貢獻(xiàn)。
[0039] 使用隨時間推移而收集的尿樣品的質(zhì)子核磁共振（1HNMR)光譜學(xué)和重量增加監(jiān) 測的組合，發(fā)明人已經(jīng)在明確定義的C57BL/6小鼠膳食誘導(dǎo)的肥胖癥模型中鑒定了指示用 于重量增加預(yù)防的益生元干預(yù)的功效的新代謝生物標(biāo)記物。本發(fā)明人使用等熱量膳食已經(jīng) 表征了用含和不含益生元的高脂肪膳食（HFD)喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠的逐步（例如每周，持 續(xù)13周）代謝適應(yīng)。發(fā)明人已經(jīng)建立了與在不同營養(yǎng)條件下逐步肥胖癥發(fā)展相關(guān)的具體 代謝簽名（metabolicsignature)，和在體重增加動力學(xué)內(nèi)的表型變異性。
[0040] 通過使用代謝組學(xué)方法，發(fā)明人已經(jīng)顯示線粒體代謝途徑（脂肪酸0氧化、支鏈 氨基酸分解代謝、丁酸酯代謝、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸途徑和Krebs循環(huán)）通過高脂肪喂養(yǎng) 被快速上調(diào)，可能反映線粒體的脂肪酸飽和以及能量代謝的損傷。此外，代謝組學(xué)分析顯示 腸道微生物代謝的顯著性重塑，如通過甲基胺、膳食碳水化合物和蛋白質(zhì)發(fā)酵的變化所觀 察到的。
[0041] 發(fā)明人可顯示，在接受基于益生元的干預(yù)的該組動物中的體重增加被阻止，并且 與體重表型的差異相關(guān)的代謝簽名與高脂肪誘導(dǎo)的肥胖癥依賴性生物學(xué)過程、包括線粒體 氧化途徑（脂肪酸P氧化）和腸道細(xì)菌代謝（甲基胺、膳食碳水化合物和蛋白質(zhì)發(fā)酵）） 的具體調(diào)節(jié)相關(guān)。
[0042] 特別地，在本文所述的實驗中，用HFD喂養(yǎng)的小鼠顯示尿中a-酮-異戊酸隨時 間推移而增加。a-酮-異戊酸的增加與最終體重增加強關(guān)聯(lián)。當(dāng)用HFD和益生元（G0S， CMOS-GOS和菊粉/F0S)喂養(yǎng)時，a-酮-異戊酸的增加被顯著地阻止或減弱，而a-酮-異 戊酸仍與最終體重增加強關(guān)聯(lián)。
[0043] 這些結(jié)果強調(diào)了線粒體和腸道微生物群在肥胖癥發(fā)展中的作用并且顯示：有益地 響應(yīng)于益生元在預(yù)防膳食誘導(dǎo)的重量增加中的可能性，可使用本文所定義的一組特定的生 物標(biāo)記物由早期代謝簽名確定。
[0044] 發(fā)明人能夠證實：在具有任何益生元的高脂肪喂養(yǎng)一周后（第7天）的尿代謝響 應(yīng)，使得能夠預(yù)測每一個體的最終體重增加（第70天）。本方法因此可以預(yù)測和/或量化 動物對啟動益生元施用后在初期階段的膳食干預(yù)的響應(yīng)。
[0045] 預(yù)測和/或量化受試者對益牛元的響應(yīng)
[0046] -方面，本發(fā)明涉及預(yù)測和/或量化受試者對益生元在預(yù)防受試者中膳食誘導(dǎo)的 重量增加中的響應(yīng)。
[0047] 例如，在一個實施方案中，該方法可用于預(yù)測未來或進(jìn)行中的益生元的施用是否 可能在預(yù)防重量增加方面有效。該方法