G-sers基底的制備方法及癌細(xì)胞檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及集成光學(xué)及醫(yī)學(xué)，尤其涉及銀納米結(jié)構(gòu)-石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)器件的制備方法及癌細(xì)胞檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是醫(yī)學(xué)上一個(gè)重大難題，從癌癥的發(fā)現(xiàn)到確診不僅浪費(fèi)較多的時(shí)間而且花費(fèi)巨額的金錢，這些問題困擾癌癥患者和醫(yī)務(wù)工作者多年。開發(fā)一種可靠、簡單、有效、低成本的手段對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和診斷是很有必要的。拉曼光譜利用光學(xué)的非彈性散射效應(yīng)發(fā)展而來的技術(shù)，經(jīng)過多年的發(fā)展，表面拉曼光學(xué)增強(qiáng)得到廣泛研究，可以用于生物檢測(cè)、成像、分子選擇等領(lǐng)域。但是，目前研究表明對(duì)癌細(xì)胞的檢測(cè)和診斷需要標(biāo)簽物質(zhì)標(biāo)記癌細(xì)胞，標(biāo)簽物質(zhì)標(biāo)記癌細(xì)胞在其過程中可能對(duì)細(xì)胞有所破壞，這不僅提高了其成本，同時(shí)也增加了相應(yīng)的難度。
[0003]利用生物熒光蛋白對(duì)癌細(xì)胞標(biāo)記，在熒光顯微鏡下能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的觀察，但生物熒光蛋白的成本較高且需要對(duì)癌細(xì)胞的提前預(yù)知。這種方式成本高，工藝復(fù)雜，需要對(duì)細(xì)胞的培育導(dǎo)致培育周期長，效率較低。
[0004]活性納米材料導(dǎo)入癌細(xì)胞，利用表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別癌細(xì)胞的方式提供了一種有效的檢測(cè)方式(專利公開號(hào)CN103487425A)，活性納米粒子的制備和導(dǎo)入是一種繁瑣、高成本的過程，電穿孔導(dǎo)入納米材料可能對(duì)活細(xì)胞帶來破壞，導(dǎo)致細(xì)胞信息的丟失，對(duì)細(xì)胞的鑒別和檢測(cè)帶來不可控的因素。
[0005]隨著表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectra, SERS)的不斷發(fā)展，科研工作者開發(fā)出越來越多的基底材料。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雖然這些基底材料利用不同工作原理增強(qiáng)表面拉曼信息各有優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記是必須經(jīng)歷的處理手段，這使得利用基底對(duì)表面拉曼光譜的增強(qiáng)遠(yuǎn)離了實(shí)際應(yīng)用。
[0006]石墨烯是近年來發(fā)展較為迅速的新型碳材料，由于其良好的化學(xué)穩(wěn)定性和良好的物理特性已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于不同領(lǐng)域。石墨烯具有良好的生物相容性，被視為一種優(yōu)秀的生物結(jié)構(gòu)材料。石墨烯的拉曼特性研究已經(jīng)較為成熟，根據(jù)石墨烯與生物質(zhì)的化學(xué)相互作用可以很好的了解生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，但是石墨烯的拉曼信號(hào)較弱，生物靈敏度較低，阻礙了其在生物探測(cè)上的應(yīng)用。由于石墨烯結(jié)構(gòu)特征一一單原子層厚度，光作用路徑短，利用其特性從而開發(fā)出了一種能夠有效增強(qiáng)石墨烯拉曼信號(hào)的方式一一石墨烯表面增強(qiáng)拉曼光譜(Graphene surface enhanced Raman spectra, G-SERS)。這是利用表面結(jié)構(gòu)對(duì)光電場(chǎng)局域以及表面等離子波增加光和石墨烯有效作用，從而增強(qiáng)石墨烯拉曼強(qiáng)度提高其靈敏度。雖然表面增強(qiáng)拉曼光譜能夠提高石墨烯拉曼信號(hào)的靈敏度，但是對(duì)單純生物質(zhì)/癌細(xì)胞的信號(hào)的增強(qiáng)有限，也限制了其實(shí)際應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，降低癌細(xì)胞檢測(cè)成本，提高檢測(cè)的可靠度，利用表面增強(qiáng)拉曼的原理設(shè)計(jì)并開發(fā)出一種簡單、通用、快捷、成本低的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌細(xì)胞的檢測(cè)。該方法能夠有效提高石墨烯表面增強(qiáng)拉曼的信號(hào)，由于癌細(xì)胞與石墨烯的相互作用使石墨烯拉曼特征峰發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的檢測(cè)，利用癌細(xì)胞和正常細(xì)胞與石墨烯之間相互作用不同所提供了特征峰發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的診斷。該方法在增強(qiáng)石墨烯拉曼的同時(shí)也能增強(qiáng)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的拉曼信號(hào)，癌細(xì)胞和正常細(xì)胞在該基底上產(chǎn)生不同的拉曼特征峰，該特征峰也為癌細(xì)胞的診斷提供有利可靠的證據(jù)。
[0008]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中問題，本發(fā)明提供了一種G-SERS基底的制備方法，G-SERS基底為銀納米結(jié)構(gòu)-石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)器件，其制備方式如下:
[0009]步驟1:金納米結(jié)構(gòu)的制備:
[0010]通過鍍膜機(jī)電子束蒸鍍的方式，超低真空度條件下，將高純金蒸鍍?cè)诠杌咨?，蒸鍍速?.5-5埃/秒，形成1-1Onm厚度的金膜，從而在娃基底上形成不同的金納米結(jié)構(gòu)；
[0011]步驟2:制備石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)基底；
[0012]步驟3:銀納米結(jié)構(gòu)-石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)器件的制備:將步驟2中得到的石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)基底置于電子束蒸鍍腔中，低真空度條件下，蒸鍍速率0.5-5埃/秒，控制時(shí)間5-20秒，在石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)基底上蒸鍍得到1-1Onm厚度的銀納米結(jié)構(gòu)，從而得到銀納米結(jié)構(gòu)-石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)器件。
[0013]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟I中所述超低真空度為低于8e_7torr，步驟3中低真空度為低于5e-7torr。
[0014]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在娃基底上形成不同的金納米結(jié)構(gòu)為納米顆粒和/或納米條。
[0015]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2中，制備石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)基底的方法為:將氧化石墨烯溶解在去離子水中形成4-10mg/ml的溶液，將其溶液利用勻膠機(jī)甩膜的方式在上述步驟I的基底上形成均勾的氧化石墨稀薄膜，制備成氧化石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)基底，將得到的氧化石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)基底置于高溫管式爐中在惰性氣體600-1000攝氏度退火處理0.5-2小時(shí)，制備成石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)基底。
[0016]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，成膜條件:低速600轉(zhuǎn)/秒，經(jīng)歷45秒；高速2000轉(zhuǎn)/秒，經(jīng)歷12秒。
[0017]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2中，制備石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)基底的方法為:將化學(xué)氣相沉積得到石墨烯通過快速轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移到上述步驟I的基底上得到石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)基底。
[0018]—種癌細(xì)胞的檢測(cè)方法，
[0019]步驟A:
[0020]將肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞各自培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液倒出，并用滴管滴加0.05-1毫升的胰酶清洗殘留的培養(yǎng)液；接著用去離子水清洗3?5次并倒出；再向培養(yǎng)瓶中加入0.05-1毫升胰酶用于將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁解離下來，并用I?500毫升去離子水將其稀釋得到肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的稀釋液；
[0021]步驟B:
[0022]分別將肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的稀釋液分別滴加在銀納米結(jié)構(gòu)-石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)G-SERS器件和硅基底上，所述G-SERS基底為權(quán)利要求1至6任意一種制備方法所得到的G-SERS基底，將其烘干得到樣品:肝癌細(xì)胞/G-SERS、正常肝細(xì)胞/G-SERS、肝癌細(xì)胞/Si和正常肝細(xì)胞/Si，用于拉曼檢測(cè)；
[0023]步驟C:
[0024]采用雷尼紹inVia拉曼光譜儀，采用1800線/毫米光柵，激發(fā)波長514.5nm作為入射光照射上述步驟A的樣品得到相應(yīng)的拉曼光譜；正常細(xì)胞/Si和肝癌細(xì)胞/Si的拉曼光譜沒有任何區(qū)別；將肝癌細(xì)胞/G-SERS通過與G-SERS器件和正常肝細(xì)胞/G-SERS的拉曼光譜對(duì)比，由于癌細(xì)胞的特異性基團(tuán)與石墨烯化學(xué)作用從而使石墨烯拉曼特征峰發(fā)生變化:石墨烯的D峰(?1350cm-l)半峰寬變窄，同時(shí)G峰(?1580cm_l)半峰寬變寬，2D峰(?2650cm-l)退化，2G峰(?2980cm_l)增強(qiáng)，并發(fā)生了峰形狀的畸化；同時(shí)在?1200cm_l、?1500cm-l、?3100cm-l處出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的癌細(xì)胞特征峰，這些為癌細(xì)胞的檢測(cè)和診斷提供了可靠的依據(jù)，而從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的檢測(cè)和鑒別。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
[0026]尺寸小:該方法制備的微納結(jié)構(gòu)器件尺寸可以小到微米。
[0027]測(cè)試效率高:利用金屬微納結(jié)構(gòu)對(duì)表面拉曼進(jìn)行增強(qiáng)，增加入射光與物質(zhì)的作用幾率，能夠使癌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)信息更為靈敏的表達(dá)出來，提高了檢測(cè)和診斷的效率。
[0028]不需要對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理和標(biāo)記:克服了現(xiàn)有技術(shù)需要提前對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的困難，同時(shí)提高了檢測(cè)診斷的準(zhǔn)確性和可靠性。
【附圖說明】
[0029]圖1不同金屬納米結(jié)構(gòu)微觀圖；
[0030]圖2金屬納米結(jié)構(gòu)在石墨烯表面的微觀圖；
[0031]圖3不同結(jié)構(gòu)及材料的反射吸收譜；
[0032]圖4表面增強(qiáng)石墨烯拉曼光譜；
[0033]圖5細(xì)胞在G-SERS基底上的光學(xué)照片；
[0034]圖6肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞在硅基底上的拉曼光譜；
[0035]圖7是銀納米結(jié)構(gòu)-石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)器件示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0037]如圖7所示，為銀納米結(jié)構(gòu)-石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)器件，其制備方式如下:
[0038]步驟1:金納米結(jié)構(gòu)的制備。
[0039]通過鍍膜機(jī)(Syskey Technology)電子束蒸鍍的方式，超低真空度(低于8e-7torr)條件下，將高純金(99.999% )蒸鍍?cè)诠杌?Si，?8mm X 10mm)上，蒸鍍速率0.5-5埃/秒，形成1-1Onm厚度的金膜，從而在娃基底上形成不同的金納米結(jié)構(gòu)(納米顆粒，納米條)。
[0040]步驟2:石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)基底的制備。
[0041]方法一:將氧化石墨烯溶解在去離子水中形成大約4-10mg/ml的溶液，將其溶液利用勻膠機(jī)(KW-4B智能勻膠機(jī))甩膜的方式在上述步驟I的基底上形成均勻的氧化石墨稀薄膜，制備成氧化石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)基底。成膜條件:低速600轉(zhuǎn)/秒，經(jīng)歷45秒；高速2000轉(zhuǎn)/秒，經(jīng)歷12秒。具有梯度轉(zhuǎn)速的成膜條件更有利于形成均勻平整的氧化石墨烯膜。將得到備的氧化石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)基底置于高溫管式爐(0TF-1200X-100，合肥科晶材料技術(shù)有限公司)中在惰性氣體(如高純氬氣，99.999% )600-1000攝氏度退火處理0.5-2小時(shí)，制備成石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)基底。
[0042]方法二:將化學(xué)氣相沉積得到石墨烯通過快速轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移到上述步驟I的基底上得到石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)基底。
[0043]步驟3:銀納米結(jié)構(gòu)-石墨稀-金納米結(jié)構(gòu)器件的制備。
[0044]將步驟2中得到的石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)基底置于電子束蒸鍍腔中，低真空度(低于5e-7torr)條件下，蒸鍍速率0.5-5埃/秒，控制時(shí)間5_20秒，在石墨烯-金納米結(jié)構(gòu)基底上蒸鍍得到1-1Onm厚度的銀納米