一種牛奶產(chǎn)品中頭孢類藥物殘留的多聯(lián)檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物源性食品中藥物殘留的檢測技術領域，是一種用高效液相色譜儀 測定牛奶產(chǎn)品中頭抱類藥物殘留量的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，獸藥在降低畜禽發(fā)病率和致死率、促進動物生產(chǎn)、改 善動物肉制品品質(zhì)和提高飼料利用率方面起到了顯著的作用，已成為現(xiàn)代畜牧業(yè)的重要支 撐。頭抱菌素類（Cephalosporins)屬于P-內(nèi)酷胺類抗生素，具有耐青霉素酶、療效高、毒 性低、過敏反應少、抗菌譜廣等特點，可有效抑制細菌的生長和繁殖。在畜牧動物養(yǎng)殖中，頭 抱類抗生素廣泛用于奶牛乳房炎的預防與治療，動物尿道、胃腸道及呼吸道等的細菌病的 治療和防治。但是在實際養(yǎng)殖過程中，由于使用方法的不規(guī)范，不但造成動物源細菌病原的 耐藥性上升，引發(fā)超劑量用藥的惡性循環(huán)，而且導致畜產(chǎn)品中的藥物殘留量的積累，引起食 品安全隱患，給人類帶來過敏、腸道菌群失調(diào)、耐藥性上升等嚴重危害。因此，中國農(nóng)業(yè)部明 確規(guī)定（農(nóng)業(yè)部560號公告）頭抱贓酬等人醫(yī)臨床控制使用的最新抗菌藥物用于食品動 物，會產(chǎn)生耐藥性問題，影響動物疫病控制、食品安全和人類健康，予W注銷產(chǎn)品批準文號， 不得再生產(chǎn)、經(jīng)營和使用。"目前對頭抱類獸藥殘留的檢測方法多為針對單個藥物的檢測， 不適應對目前多種頭抱類獸藥進行監(jiān)控，因此，建立一種準確、穩(wěn)定的多聯(lián)檢測方法對于實 現(xiàn)該類藥物的有效監(jiān)控具有重要意義。
[0003] 中國專利（CN200910085945. 7)公開了一種檢測頭抱類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及 其應用，通過酶聯(lián)免疫法對頭抱類獸藥殘留進行檢測，只能通過吸光值粗略判斷殘留量，抗 體制備步驟繁瑣，檢出限高，不易用作精確定量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種定量檢測牛奶產(chǎn)品中頭抱類抗生素殘留的 多聯(lián)檢測方法，滿足對畜牧臨床領域禁用的頭抱類抗生素的多聯(lián)檢測需求。本發(fā)明對頭 抱贓酬、頭抱嚷朽、頭抱曲松、頭抱嚷吩等4種頭抱類藥物的檢出限為分別為0. 26mg/kg、 0. 01mg/Kg、0. 10mg/kg、0. 07mg/Kg;在Img/kg~50mg/kg添加濃度范圍內(nèi)線性關系良好，回 收率為90%~105% ;本方法的批內(nèi)相對標準偏差《15%，批間相對標準偏差《20%。
[0005] 本發(fā)明的技術方案是一種檢測牛奶中頭抱類抗生素的多聯(lián)檢測方法，包括樣品預 提取、標準曲線繪制、儀器檢測分析步驟，所述檢測方法為使用高效液相色譜進行的一種多 聯(lián)檢測方法，同時檢測的藥物包括頭抱贓酬、頭抱嚷目虧、頭抱曲松、頭抱嚷吩，具體包括如下 步驟：
[0006] (1)樣品預提取：稱取牛奶樣品置于離屯、管中，加入蛋白清除劑，超聲波處理后離 屯、，吸取上清液至試管中，氮氣吹干，加入與樣品等體積的甲醇-0. 1 %甲酸溶液復溶，加入 脂肪清除劑去除脂肪，振蕩，離屯、，棄去正己燒后液體經(jīng)有機濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至棟色瓶中， 備用；
[0007] 優(yōu)選為稱取牛奶樣品置于離屯、管中，加入乙臘，超聲波處理，500化pm離屯、lOmin， 吸取上清液至試管中，氮氣吹干，加入與樣品等體積甲醇-0. 1 %甲酸溶液復溶，加入正己燒 去除脂肪，振蕩，500化pm離屯、lOmin，棄去正己燒，經(jīng)有機濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至棟色瓶中，備 用；
[000引 似標準溶液配制及標準曲線的繪制：取標準工作液，用甲醇-0. 1 %甲酸溶液進 行不同倍數(shù)稀釋，繪制標準曲線；
[0009] 優(yōu)選為分別準確稱取頭抱贓酬、頭抱嚷朽、頭抱曲松、頭抱嚷吩標準品各lOOmg，用 甲醇-0. 1%甲酸溶解并定容到4個lOmL棟色容量瓶中配制成單標準品溶液，再分別吸取適 量單標準品溶液轉(zhuǎn)移至1個lOmL棟色容量瓶中精確定容，配制成濃度為Img/血的混合標 準品儲備溶液。再用甲醇-0. 1 %甲酸溶液將混合標準品溶液經(jīng)適當稀釋，配制成濃度分別 為 0. 001mg/mL、0. 005mg/mL、0. 010mg/mL、0. 020mg/mL、0. 050mg/mL的混合標準品工作液， 采用高效液相色譜儀進行分析，繪制標準曲線，計算標準回歸方程；
[0010] 做將步驟（1)所得樣品進高效液相色譜儀器檢測，將檢測結(jié)果與所述標準曲線 對比得到待測物濃度。
[0011] 優(yōu)選條件為采用Agilent1100型高效液相色譜儀；Agilent(C18,4. 6X250， 5ym)Z0RBAXEclipsePlus反相色譜柱；流動相為A-甲醇，B-0. 1%甲酸溶液，A:B(體積 比）=3 : 7~4 : 6;檢測波長為254皿;流速為Iml/min;柱溫為35°C;進樣量為20iil。
[0012] 進一步的，所述步驟（1)中的超聲波處理方法為間歇式，超聲波處理5秒，間歇5 秒，60個循環(huán)。
[0013] 進一步的，所述步驟（1)中的蛋白清除劑為乙臘，樣品液與乙臘的體積比為 1 : 3 ~1 : 4。
[0014] 進一步的，所述步驟（1)中的脂肪清除劑為正己燒，樣品液與正己燒的體積比為 2 : 1 ~2. 5 : 1。
[0015] 進一步的，所述甲醇-0.1 %甲酸溶液，甲酸與0.1 %甲酸的體積比為3 : 7~ 4 ： 6。
[0016] 進一步的，所述步驟（1)中的有機濾膜為兩步過濾，即先經(jīng)0.45ym有機濾膜過 濾，濾過液再經(jīng)0. 22ym有機濾膜過濾?？捎行コ龢悠分懈蓴_物質(zhì)，縮短處理時間，提高 效率。
[0017] 進一步的，所述樣品為液態(tài)純奶產(chǎn)品或者奶粉產(chǎn)品。
[0018] 本發(fā)明的檢測流程如下：
[001引 （1)樣品預處理
[0020] 稱取5g牛奶樣品，精確至0.Olg，將樣品置于離屯、管中，加入15~20血乙臘，超聲 波振蕩，即超聲5秒，間隔5秒，60個循環(huán)，500化pm離屯、lOmin，取上清液，吸取上清液至試 管中，氮氣吹干，加入甲醇-0.1%甲酸溶液（V/V3 : 7~4 : 6)復溶，加入2~2. 5血正 己燒除脂，振蕩，500化pm離屯、lOmin，棄去正己燒，先后經(jīng)0. 45ym和0. 22ym濾膜過濾后 進高效液相色譜儀分析。
[0021] (2)檢測條件設定
[0022]條件為采用Agilent1100型高效液相色譜儀；Agilent(C18,4. 6X250,5ym) ZORBAXEclipsePlus反相色譜柱；流動相為A-甲醇，B-0. 1%甲酸溶液，A:B(體積比） =3 : 7~4 : 6 ;檢測波長為254nm;流速為Iml/min;柱溫為35°C;進樣量為20y1。
[002引 做標準曲線繪制
[0024] 分別準確稱取頭抱贓酬、頭抱嚷朽、頭抱曲松、頭抱嚷吩標準品各lOOmg，用甲 醇-0. 1%甲酸溶解并定容到4個lOmL棟色容量瓶中配制成單標準品溶液，再分別吸取適量 單標準品溶液轉(zhuǎn)移至1個lOmL棟色容量瓶中精確定容，配制成濃度為Img/血的混合標準 品儲備溶液。再用甲醇-0. 1 %甲酸溶液將混合標準品溶液經(jīng)適當稀釋，配制成濃度分別為 0. 001mg/mL、0. 005mg/mL、0. 010mg/mL、0. 020mg/mL、0. 050mg/mL的混合標準品工作液，義用 高效液相色譜儀進行分析，繪制標準曲線，計算標準回歸方程。
[0025] (4)將步驟1所得樣品經(jīng)高效液相色譜儀器檢測，將檢測結(jié)果與所述標準曲線對 比得到待測物檢測結(jié)果。
[002引 妨空白實驗
[0027] 除不加試樣外，均按上述測定條件和步驟進行。
[002引 （6)結(jié)果測定
[002引①定性測定
[0030] 在同樣測試條件下，試樣液中目標化合物的保留時間與標準工作液中目標化合物 的保留時間之比，偏差在±5%W內(nèi)。
[0031] ②定量測定
[0032] 取試樣溶液和相應的標準工作液，作多點校準，按外標法W峰面積定量。標準溶液 及試樣溶液中的響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。
[0033] ③結(jié)果計算和表述
[0034] 按式（a)計算試樣中頭抱類抗生素的殘留量
[0035]式中：
[003引 X-試樣中頭抱類抗生素的殘留量，mg/kg;
[0037] C-試樣溶液中頭抱類抗生素的濃度，yg/血；
[003引 V-最終樣液定容體積，血；
[00測 f-稀釋倍數(shù)；
[0040]m-試樣量，g。
[0041] 注：計算結(jié)果需扣除空白值。測定結(jié)果用兩次平行測定的算術平均值表示，保留= 位有效數(shù)字。
[0042] ④方法靈敏度、準確度和精密度
[0043] 靈敏度：本方法對頭抱贓酬、頭抱嚷目虧、頭抱曲松、頭抱嚷吩等4種頭抱類藥物的 檢出限為分別為0. 26mg/Kg、0. 01mg/Kg、0. 10mg/Kg、0. 07mg/Kg。
[0044] 準確度：本方法對在Img/kg~50mg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為90%~105%。 [004引精密度：本方法的批內(nèi)相對標準偏差《15%，批間相對標準偏差《20%。
[0046] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比的有益效果是：
[0047] 1、本發(fā)明采用高效液相色譜法測定牛奶中頭抱類抗生素的殘留量，流動相使用甲 醇和0.1%甲酸溶液，配比為3 : 7~4 : 6,可W將4種藥物完全分開，保證靈敏度，避免 了彼此干擾。
[0048] 2、提取液使用乙臘，可W有效去除蛋白質(zhì)及部分脂肪類干擾物質(zhì)；在樣品提取過 程中采用正己燒去脂，可W有效去除樣品基質(zhì)中脂肪等干擾物質(zhì)。
[0049] 3、本發(fā)明先后用0. 45ym和0. 22ym濾膜過濾的方式進行上樣前處理，可有效去 除樣品中干擾物質(zhì)，縮短處理時間，提高效率。
[0050] 4.本方法填補了目前頭抱類檢測方法均為針對單一藥物的局限性，豐富了多聯(lián)檢 測方法，使其更具有適用性，有利于食品安全的有效監(jiān)控。
【附圖說明】
[0051] 圖1 :頭抱曲松的保留時間；
[005引圖2 :頭抱嚷目虧的保留時間；
[0053] 圖3 :頭抱贓酬的保留時間；
[0054] 圖4 :頭抱嚷吩的保留時間；
[00巧]圖5 :頭抱類抗生素的分離譜圖；
[005引 圖6:頭抱曲松標準曲線圖；
[0057]圖7 :頭抱嚷朽標準曲線圖；
[005引 圖8:頭抱贓酬標準曲線圖；
[005引圖9 :頭抱嚷吩標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0060] 下面通過實施例詳細敘述本發(fā)明的技術內(nèi)容。本領域技術人員應當理解，下述實 施例均用于對本發(fā)明所要求保護的范圍進行實例性的描述，W此概括本發(fā)明的各參數(shù)的相 對范圍，因此不能將之理解為對本發(fā)明的一種限制。
[0061] 牛奶產(chǎn)品主要分為液態(tài)和固態(tài)，因此，本發(fā)明選擇牛奶中最具有代表性的液態(tài)奶 和奶粉作為驗證的實施例。
[0062] 實施例