一種獼猴桃莖三萜類hplc指紋圖譜建立及其指紋圖譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品藥品管理領(lǐng)域，尤其涉及一種獼猴桃莖三萜類HPLC指紋圖譜建 立及其指紋圖譜。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥指紋圖譜特指中藥樣本經(jīng)光譜或色譜等現(xiàn)代分析技術(shù)得到的中藥各組分群 體特征的圖譜或圖像。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制手段，目前，已被 眾多國(guó)際性醫(yī)藥機(jī)構(gòu)所承認(rèn)，已成為中成藥、天然藥物質(zhì)量控制最有效的方法之一。美國(guó)食 品藥品管理局在1996年制定的《FDA關(guān)于植物制品的指南》中，要求對(duì)植物原料、植物藥中 間品和植物藥產(chǎn)品提供相應(yīng)的指紋圖譜。英國(guó)草藥典、印度草藥典以及加拿大藥用及芳香 植物學(xué)會(huì)、德國(guó)藥用植物學(xué)會(huì)也接受色譜指紋圖譜。中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén)于2000年 發(fā)布了《中藥注射劑的指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》，明確要求對(duì)新申報(bào)的中藥注射 劑和已上市的中藥注射劑實(shí)行指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)。中藥指紋圖譜經(jīng)過(guò)了數(shù)十年的研究，使用了 包括紫外、紅外、氣相、高效液相、薄層、核磁共振、掃描電子顯微鏡、計(jì)算機(jī)圖像分析、電泳 技術(shù)、同功酶分析法、分子生物學(xué)技術(shù)、聚類分析技術(shù)等許多現(xiàn)代分析測(cè)試手段，為中藥的 物質(zhì)鑒定和成分分析積累了大量的數(shù)據(jù)。但從中藥全面質(zhì)量控制的角度看，還遠(yuǎn)未達(dá)到有 效地反映和控制中藥的整體質(zhì)量的目的。高效液相色譜（HPLC)指紋圖譜在國(guó)際上容易獲 得認(rèn)可，包括美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)、加拿大、德國(guó)、日本和印度在內(nèi)的許多國(guó)家更愿意接受HPLC 指紋圖譜。因此，為中藥材建立相應(yīng)的HPLC指紋圖譜，是現(xiàn)階段控制中藥內(nèi)在質(zhì)量的有效 手段。四川是獼猴桃最大的主產(chǎn)區(qū)之一，其根，藤梨根，作為解毒抗癌藥材在《江西草藥》、 《湖南藥物志》、《浙江民間常用草藥》、《福建民間草藥》、《閩東本草》、《陜西中草藥》中都有記 載，報(bào)道根中先后分離出糖類、三萜、黃酮等化合物；另具調(diào)查，由于根資源有限，目前中藥 材市場(chǎng)購(gòu)進(jìn)的藤梨根90%以莖充根。從獼猴桃栽培看，每年入冬有大量修枝，莖葉、疏花廢 棄；因此建立枝條、葉、花有效成分指紋圖譜，是既解決質(zhì)量評(píng)價(jià)方式單一，不足以系統(tǒng)、完 整地表明藥材的整體質(zhì)量，亟需探索更先進(jìn)、更有效的質(zhì)量控制手段問(wèn)題；又能使獼猴桃資 源充分利用。
[0003]目前獼猴桃枝條、葉、花三萜類指紋圖譜未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種獼猴桃莖三萜類HPLC指紋圖譜建立及其指紋圖譜， 旨在由于野生獼猴桃資源的枯竭，藥材市場(chǎng)以其它根冒充、或用獼猴桃枝條莖替代藤梨根 藥材成為常態(tài)，而監(jiān)控缺乏判斷能否替代的內(nèi)在質(zhì)量證據(jù)，也不能評(píng)判不同品種、部位、產(chǎn) 地獼猴桃根莖作藥材品質(zhì)的優(yōu)劣（即有效部位含量高低）。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種獼猴桃莖三萜類HPLC指紋圖譜建立方法，所述的獼猴 桃莖三萜類HPLC指紋圖譜建立方法采用高效液相色譜法，具體的步驟如下：
[0006] 步驟一，對(duì)照品溶液的制備，精密稱取齊墩果酸對(duì)照品和熊果酸對(duì)照品，加甲醇制 成每1ml各含0.1 mg的混合溶液，搖勻，即得；
[0007] 步驟二，供試品溶液的制備，將藥材粉碎后，取4. 0g，置于圓底燒瓶中，加入40ml 甲醇，稱定重量，加熱回流lh，放冷，用甲醇補(bǔ)齊重量，搖勻，取上清液離心，即得；
[0008] 步驟三，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0. 2%甲酸水 溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；
[0009] 步驟四，分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μ 1與供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀， 測(cè)定，即得，以齊墩果酸和熊果酸分別計(jì)算出總?cè)坪浚罱K結(jié)果以平均值計(jì)。
[0010] 進(jìn)一步，所述梯度洗脫以如下體積濃度配置進(jìn)行：
[0011] 〇分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為30 %的乙腈溶液，流動(dòng)相B為70 %的0. 2 %甲酸水溶液；
[0012] 16分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為45%的乙腈溶液，流動(dòng)相B為55%的0. 2%甲酸水溶液；
[0013] 22分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為46 %的乙腈溶液，流動(dòng)相B為54 %的0. 2 %甲酸水溶液；
[0014] 30分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為54 %的乙腈溶液，流動(dòng)相B為46 %的0. 2 %甲酸水溶液；
[0015] 34分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為66 %的乙腈溶液，流動(dòng)相B為34 %的0. 2 %甲酸水溶液；
[0016] 38分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為70 %的乙腈溶液，流動(dòng)相B為30 %的0. 2 %甲酸水溶液；
[0017] 46分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90%的乙腈溶液，流動(dòng)相B為10%的0. 2%甲酸水溶液；
[0018] 56分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90%的乙腈溶液，流動(dòng)相B為10%的0. 2%甲酸水溶液；
[0019] 57分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為30 %的乙腈溶液，流動(dòng)相B為70 %的0. 2 %甲酸水溶液；
[0020] 69分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為30 %的乙腈溶液，流動(dòng)相B為70 %的0. 2 %甲酸水溶液。
[0021] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種獼猴桃莖三萜類HPLC指紋圖譜，所述獼猴桃莖 三萜類HPLC指紋圖譜的建立，具體包括以下步驟：
[0022] 步驟一，對(duì)照品溶液的制備，精密稱取齊墩果酸對(duì)照品和熊果酸對(duì)照品，加甲醇制 成每1ml各含0.1 mg的混合溶液，搖勻，即得；
[0023] 步驟二，供試品溶液的制備，將藥材粉碎后，取4. 0g，置于圓底燒瓶中，加入40ml 甲醇，稱定重量，加熱回流lh，放冷，用甲醇補(bǔ)齊重量，搖勻，取上清液離心，即得；
[0024] 步驟三，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0. 2%甲酸水 溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；
[0025] 步驟四，分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μ 1與供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀， 測(cè)定，即得，以齊墩果酸和熊果酸分別計(jì)算出總?cè)坪?，最終結(jié)果以平均值計(jì)；
[0026] 所述指紋圖譜中有共有峰15個(gè)；
[0027] 1號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為6. 56min，峰面積為18213, RSD為6. 10% ;
[0028] 2號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為IL 21min，峰面積為23654, RSD為L(zhǎng) 93% ;
[0029] 3號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為12. 68min，峰面積為2630, RSD為0. 88% ;
[0030] 4號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為13. 46min，峰面積為5384, RSD為1. 80% ;
[0031] 5號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為15. 7lmin，峰面積為2009, RSD為0. 67% ;
[0032] 6號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為19. 29min，峰面積為2286, RSD為0. 76% ;
[0033] 7號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為25. 39min，峰面積為2758, RSD為0. 92% ;
[0034] 8號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為28. 89min，峰面積為3299, RSD為1. 10% ;
[0035] 9號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為29. 29min，峰面積為6543, RSD為2. 19% ;
[0036] 10號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為35. 31min，峰面積為2784, RSD為0· 93% ;
[0037] 11號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為40. 86min，峰面積為73140, RSD為24. 51% ;
[0038] 12號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為41. 74min，峰面積為6092, RSD為2. 04% ;
[0039] 13號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為46. 16min，峰面積為1662, RSD為0. 55% ;
[0040] 14號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為50. 54min，峰面積為4755, RSD為1. 59% ;
[0041] 15號(hào)峰，平均保留時(shí)間RT為-min，峰面積較小，RSD為-。
[0042] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0043] 獼猴桃根（藤梨根，軟棗獼猴桃根）用作敗毒抗癌、清熱消腫藥材，在我國(guó)已有上 千年歷史，但隨著野生資源的枯竭出現(xiàn)藥材斷層，中藥材市場(chǎng)常用獼猴桃枝條冒充根，魚(yú)目 混雜，質(zhì)量難以保證。本發(fā)明指紋圖譜研究，可將不同品種、不同部位（枝條、花、根）與軟 棗獼猴桃根進(jìn)行比較，通過(guò)比較其共有峰，證明枝條是根的延伸部位，具有同源同質(zhì)屬性， 而花與枝條、根之間細(xì)微差異也能凸顯；通過(guò)獼猴桃三萜類指紋圖譜建立，可以區(qū)分供替代 藤梨根作藥材的獼猴桃枝條與其它植物根的差別，為獼猴桃枝條替代藤梨根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 的制定奠定基礎(chǔ)。
[0044] 此外，本發(fā)明將獼猴桃枝條、葉、花藥材作為一個(gè)整體對(duì)待，通過(guò)比較其共有峰可 以找出不同藥材之間的細(xì)微差異；供試品制作簡(jiǎn)便，色譜條件容易實(shí)現(xiàn)；方法的穩(wěn)定性和 重現(xiàn)性都比較好；適于對(duì)獼猴桃枝條、葉、花藥材真?zhèn)?、產(chǎn)地和品質(zhì)的鑒別和控制。
【附圖說(shuō)明】
[0045] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的獼猴桃莖三萜類HPLC指紋圖譜建立方法流程圖；
[0046] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的枝與根比較三萜類20個(gè)共有峰，花蕾與根比較三萜類 15個(gè)共有峰示意圖；
[0047] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的8個(gè)品種獼猴桃枝與根比較三萜類指紋圖譜相似度 高，花蕾與根比較三萜類指紋圖譜相似度低示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案