一種茶葉多糖單糖組成的快速定量方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于茶葉化學領域，更具體涉及一種茶葉多糖單糖組成的快速定量方法。
【背景技術】
[0002] 茶多糖是（Tea Polysaccharide)是茶葉中重要的活性物質，具有免疫、降血糖、防 福射、抗氧化、降血脂等多種功能。
[0003] 茶多糖是一種酸性糖蛋白，其活性與分子量大小和單糖組成有著密切的聯(lián)系。檢 測茶多糖的單糖組成對研究其生物活性有很大的幫助。多糖中單糖組成的檢測方法主要 包含顯色法、毛細管電泳法、氣相色譜法、薄層層析色譜法、液相色譜法等。蘇冰霞（山苦 茶多糖的分離和含量測定，2012,熱帶作物學報，Vol. 33(3) :567-571)、傅博強（茶葉中多 糖含量的測定，2001，食品科學，22(11) :69-73)等人的非專利文獻表明，顯色法只能測定 茶多糖中總糖的含量，并不能定量分析茶多糖的單糖組成；丁侃（多糖類藥物的毛細管電 泳分析方法及其應用，1999,色譜，Vol. 17(4) :346-252)、張麗芝（單糖組成分析方法的研 究進展，2013,微生物學免疫學進展，Vol. 41 (1)77-81)等人的非專利文獻表明，利用毛細管 電泳分離多糖組成，多糖的分離度較差；丁婧思（茶葉酸性多糖的分離、純化以及理化性質 研究，2014,食品科學，Vol. 35(23) :57-60)、陳海霞（高活性茶多糖的一級結構表征、空間 構象及生物活性的研究，2002,華中農業(yè)大學）等人的非專利文獻表明，氣相色譜法中由于 單糖并不易揮發(fā)，導致衍生化過程復雜且不穩(wěn)定，衍生后容易產生異構體，且不能檢測糖醛 酸含量；顏軍（TLC快速分析多糖的單糖組成，2006,食品科學，Vol. 27 (12) :603-607)等人 的非專利文獻表明，薄層析法靈敏度比較低，分析不精確；屠幼英（綠茶飲料中茶多糖的構 成，2001，茶葉，Vol. 27(2) :22-24)等人的非專利文獻表明，普通液相色譜法分析要采用糖 柱或氨基柱，價格昂貴且維護費用較高，而且需要很長時間來平衡。鄧靜（高效液相色譜法 和化學計量學在白茶及其多糖質量控制中的應用，2014,南昌大學）、郭威（柱前衍生HPLC 法分析普洱茶多糖的單糖組成，農業(yè)科學與技術，2013, Vol. 14(4) :556-558)等人的非專 利文獻利用柱前衍生HPLC法分析白茶、普洱茶多糖的單糖組成，但分析時間在40min以上， 且部分單糖間分離效果有待提高。顯然，如何找到一種分析時間更快，分離效果更好的方 法用于茶葉多糖中單糖組成的分析顯得十分必要。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，是在于提供了一種茶葉多糖單糖組成的定 量方法，方法易行、快速、方便、穩(wěn)定，使其達到了在20min內進行單糖的分離與分析，分離 效果及精密度明顯優(yōu)于現(xiàn)行方法，提高了茶多糖單糖檢測的準確度。
[0005] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)： 一種茶葉多糖單糖組成的快速定量方法，其步驟包括現(xiàn)將茶多糖進行酸水解，然后進 行衍生化，其步驟還包括以海藻糖為內標物，利用高效液相色譜儀進行分析與檢測，在此過 程中將所述的單糖快速分離與定量分析。
[0006] -種茶葉多糖單糖組成的快速定量方法，其步驟如下： (1) 將茶葉多糖置于安瓿管中，加入一定量的2. Omol/L的三氟乙酸，真空封管后于 130°C下水解120分鐘，冷卻至室溫后氮氣吹干，得到水解多糖樣品； (2) 將水解多糖用超純水充分溶解，加入海藻糖作為內標物，得到含內標的水解多糖溶 液； (3) 在含內標的水解多糖溶液100 μ L中按照體積比1 :2 :3的比例依次加入0. 5mol/ L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)甲醇溶液200 μ L和0. 3mol/L氫氧化鈉溶液 (NaOH) 300 μ L，均勻混合后在70°C水浴反應60分鐘進行衍生化，將反應液冷卻至室溫，用 0. 3mol/L HCL溶液300 μ L中和，得到衍生化多糖溶液； (4) 在多糖衍生化的同時進行標準單糖的衍生化，即先用超純水配置0. lmol/L的單糖 溶液，然后取等量單糖溶液混合成單糖標準品混合液，按照步驟（3)進行標準單糖和標準 單糖混合液的衍生化，得到衍生化標準單糖和衍生化混合標準單糖溶液； (5) 在衍生化多糖、衍生化標準單糖和衍生化混合標準單糖溶液中分別加入氯仿萃取， 上清液經0. 45 μ m微孔濾膜過濾，得到HPLC分析樣； (6) HPLC分析條件為：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；流動相A選用磷 酸二氫鉀-三乙胺與乙腈組成的緩沖溶液；流動相B選用乙腈；洗脫過程采用梯度洗脫，從 0-20分鐘，流動相B相應的濃度為6% -12% ;柱溫35°C，流速為1.0 ml/min，紫外檢測器， 波長250nm ; (7) 根據圖譜中各單糖保留時間進行茶葉多糖中所含單糖的定性分析，根據圖譜中各 單糖峰面積大小進行茶葉多糖中所含單糖的定量分析。
[0007] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下積極效果： 1、提高單糖的分離效果：可一次性分離茶多糖中所含單糖，包括葡萄糖醛酸和半乳糖 醛酸，各單糖峰峰型尖銳，分離效果顯著。
[0008] 2、分析時間縮短：利用本發(fā)明提供的HPLC分析條件，可在20min內完成單糖的分 尚與分析。
[0009] 此外，所使用的設備比較常見，方法容易實現(xiàn)，檢測成本較低。
[0010] 通過查閱，經檢索到與本發(fā)明相關的非專利文獻10余篇，本發(fā)明與相關文獻主要 技術特征和實施效果的比較見表1 一表4。技術方案不同，所達到的技術效果不一樣，本發(fā) 明通過現(xiàn)有技術相比，都遠遠高于現(xiàn)有技術的效果。利用本發(fā)明技術可以一次性完成茶葉 多糖中單糖的組成分析，分離時間控制在20min內；各單糖組均分具有良好的線性關系，相 關系數(shù)達到0. 998以上；各單糖組分保留時間與峰面積CV%均小于3. 75,精密度高；各單 糖組分的回收率在93. 6% -102. 6%之間，準確度高。
【附圖說明】
[0011] 圖1為一種標準單糖樣品HPLC檢測色譜圖。
[0012] 圖2為一種茶葉多糖HPLC檢測色譜圖。
[0013] 其中：1 一甘露糖、2 -核糖、3 -鼠李糖、4 一葡萄糖醛酸、5 -半乳糖醛酸、6 -葡 萄糖、7 -木糖、8 -半乳糖、9 一阿拉伯糖、10 -海藻糖。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1 : 一種茶葉多糖單糖組成的快速定量方法，其步驟如下： (1) 將茶葉多糖IOmg置于安瓿管中，加入一定量的2. Omol/L的三氟乙酸，真空封管后 于130°C下水解120分鐘，冷卻至室溫后氮氣吹干，得到水解多糖； (2) 將水解多糖用超純水充分溶解，加入海藻糖作為內標物，得到含內標的水解多糖溶 液； (3) 在含內標的水解多糖溶液100 μ L中按照體積比1 :2 :3的比例依次加入0. 5mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)甲醇溶液200 μ L和0· 3mol/L NaOH溶液300 μ L，均 勻混合后在70°C水溶液中反應60分鐘進行衍生化，將反應液冷卻至室溫，用0. 3mol/L HCL 溶液300 μ L中和，得到衍生化多糖溶液； (4) 在多糖衍生化的同時進行標準單糖的衍生化，即先用超純水配置0. lmol/L的單糖 溶液，然后取等量單糖溶液混合成單糖標準品混合液，按照上述方法（3)進行標準單糖和 標準單糖混合液的衍生化，得到衍生化標準單糖和衍生化混合標準單糖溶液； (5) 在衍生化多糖、衍生化標準單糖和衍生化混合標準單糖溶液中分別加入1ml氯仿 萃取3次，上清液經0. 45 μ m微孔濾膜過濾，得到HPLC分析樣； (6) HPLC分析條件為：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；流動相A選用磷 酸二氫鉀-三乙胺與乙腈組成的緩沖溶液；流動相B選用純乙腈；洗脫過程采用梯度洗脫， 從0-20分鐘，流動相B相應的濃度為6% -12% ;柱溫35°C，流速為l.Oml/min，紫外檢測 器，波長250nm ; (7) 根據圖譜中衍生化標準單糖和混合標準單糖保留時間進行多糖中所含單糖的定 性，根據圖譜中衍生化標準單糖和混合標準單糖峰面積大小定量。
[0015] 在本實施例中所采用的儀器、試劑、色譜條件、標準溶液的制備、茶葉多糖樣品溶 液制備、方法學驗證試驗、分析條件的確定如下。
[0016] 1、儀器與試劑： 1. 1儀器： Agilent 1260HPLC system(美國安捷倫）；水浴鍋HH-2(常州國華）； AW-220電子天平（日本島津） 1. 2試劑： 超純水；甲醇，乙腈均為色譜純美國Fisher scientific公司；甘露糖、核糖、鼠李糖、 葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖