一種肝微粒體中1-羥基咪達(dá)唑侖濃度的uplc/ms/ms檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物的檢測(cè)方法，具體涉及肝微粒體中1-羥基咪達(dá)唑侖濃度的UPLC/ MS/MS檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CYP450酶是參與藥物代謝的主要酶系，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等與藥物代謝密切相關(guān)的同工酶。研究表明，大部分藥物-藥 物相互作用的發(fā)生與CYP450酶活性的誘導(dǎo)和抑制相關(guān)，其中主要由酶抑制引起。利用體外 方法進(jìn)行藥物代謝研究，可有效縮短新藥研發(fā)周期，直接觀察酶對(duì)底物的選擇性代謝和底 物對(duì)酶的誘導(dǎo)和抑制，確定藥物代謝途徑，預(yù)測(cè)體內(nèi)潛在的藥物相互作用。目前，常用的體 外方法為探針?biāo)幬锓ǎ摲椒ㄍㄟ^(guò)建立肝微粒體溫孵體系，從而建立了藥物代謝研究模型。
[0003] 1-羥基咪達(dá)唑侖（Γ -Hydroxymidazolam)是CYP3A4探針底物咪達(dá)唑侖的代謝產(chǎn) 物。目前，已有專(zhuān)利CN 102080122A報(bào)道了一種肝微粒體中1-羥基咪達(dá)唑侖濃度的HPLC/ MS/MS檢測(cè)方法。但是，該方法的梯度洗脫程序持續(xù)8分鐘，耗時(shí)較長(zhǎng)，進(jìn)樣量較大，不適于 單獨(dú)檢測(cè)1-羥基咪達(dá)唑侖的濃度。
[0004] 因此，目前亟需一種專(zhuān)屬性更強(qiáng)，更為快速的肝微粒體中1-羥基咪達(dá)唑侖濃度的 檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種肝微粒體中1-羥基咪達(dá)唑侖濃度的UPLC/ MS/MS檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0006] (1)建立肝微粒體溫孵體系，加入內(nèi)標(biāo)物和系列濃度的1-羥基咪達(dá)唑侖對(duì)照品， 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品；
[0007] (2)將標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)；
[0008] 色譜條件如下：
[0009] 色譜柱：C18色譜柱；
[0010] 流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0. 1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0. 1 %甲酸乙腈溶液；
[0011] 梯度洗脫條件為：
[0012]
[0013] 運(yùn)行時(shí)間為3分鐘；
[0014] 質(zhì)譜條件如下：
[0015] 離子源：電噴霧離子源；
[0016] 檢測(cè)方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；
[0017] 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得到1-羥基咪達(dá)唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0018] ⑶按照步驟⑴相同的方法，將底物咪達(dá)唑侖與肝微粒體溫孵體系共溫孵，制備 得到含有內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)樣品，將待測(cè)樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，按照步驟（2)相同 的條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)樣品中的1-羥基咪達(dá)唑侖濃度。
[0019] 其中，溫孵的時(shí)間為20min。
[0020] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)物為鄰甲苯海拉明。
[0021] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，流動(dòng)相的流速為0. 3mL/min。
[0022] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，柱溫為40°C。
[0023] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，色譜柱為ACQUITY UPLC-BHl C18色譜柱，規(guī)格為 1. 7 μ m, 2. I X 50mm〇
[0024] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，進(jìn)樣量為0. 2 μ L。
[0025] 優(yōu)選地，所述正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)中，1-羥基咪達(dá)唑侖的母離子-子離子對(duì)為m/ z342. 08 - m/z 323. 94,錐孔電壓為14V，碰撞電壓為20V ;鄰甲苯海拉明的母離子-子離子 對(duì)為m/z 270. 10 -m/z 181.08，錐孔電壓為15￥，碰撞電壓為12￥。
[0026] 優(yōu)選地，所述質(zhì)譜條件中，毛細(xì)管電壓為3000V，離子源溫度為150°C，去溶劑化溫 度為350°C，去溶劑化氣體流速為650L/h。
[0027] 優(yōu)選地，所述質(zhì)譜條件中，錐孔氣體流速為150L/h，霧化氣壓力為6. Obar。
[0028] 優(yōu)選地，所述步驟（1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品制備方法為：將1-羥基咪達(dá)唑侖加入肝微 粒體溫孵體系，所述肝微粒體溫孵體系包含肝微粒體、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶、MgCl 2、PBS和NADP，再加入含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，混勾，離心，取上清液，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣 品。
[0029] 其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品的制備可以按照下述方法進(jìn)行：分別將系列濃度的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn) 品1-羥基咪達(dá)唑侖加入肝微粒體溫孵體系（包含肝微粒體、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶、MgCl 2、PBS和NADP)，再加入含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，充分混勻3min，于4°C，13000rpm 離心10min，取上清液即得。肝微?？梢圆捎萌恕⒋笫?、小鼠、犬、恒河猴、食蟹猴的肝微粒。
[0030] 不同于現(xiàn)有的HPLC方法，本發(fā)明是UPLC方法，專(zhuān)一地檢測(cè)對(duì)肝微粒體中的對(duì) 1-羥基咪達(dá)唑侖濃度，將8分鐘的色譜分析時(shí)間大幅縮短為了 3分鐘，分析時(shí)間短、靈敏度 高、進(jìn)樣量小。同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、基質(zhì)效應(yīng)小、線(xiàn)性范圍廣、批內(nèi)和批間準(zhǔn)確 度與精密度高、進(jìn)樣盤(pán)穩(wěn)定性高、工作液穩(wěn)定性高，符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，適用于肝微粒體 溫孵樣本中1-羥基咪達(dá)唑侖濃度的測(cè)定，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0031] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0032] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 所用肝微粒體為人肝微粒體。
[0034] 圖1為母離子和錐孔電壓的優(yōu)選結(jié)果。
[0035] 圖2的質(zhì)譜條件為：離子對(duì)：m/z 342. 08 - m/z 323. 94,錐孔電壓14V，碰撞電壓 20V，也即本發(fā)明的質(zhì)譜條件。
[0036] 圖3的質(zhì)譜條件為：離子對(duì)：m/z 342. 08 - m/z 203. 04,錐孔電壓14V，碰撞電壓 28V〇
[0037] 圖4的質(zhì)譜條件為：離子對(duì)：m/z 342. 08 -m/z 167. 95,錐孔電壓14V，碰撞電壓 38V〇
[0038] 圖5為空白樣本的色譜圖。
[0039] 圖6為L(zhǎng)LOQ (定量下限）樣本色譜圖。
[0040] 圖7為待測(cè)樣本色譜圖。
[0041] 圖8為1-羥基咪達(dá)唑侖典型標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
【具體實(shí)施方式】
[0042] 實(shí)施例1
[0043] 所述試劑和儀器均來(lái)自市售的商品。
[0044] 1、對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)
[0045] 1-羥基咪達(dá)唑侖（OH-MDZ):分子量 341. 77,純度99. 4%，批號(hào) 1385527 (sigma-ald rich)；
[0046] 梓檬酸鄰甲苯海拉明（正離子內(nèi)標(biāo)）：純度99%，批號(hào)048F0510V(sigma-aldrich)。
[0047] 2、主要儀器
[0048]
[0049] 3、試驗(yàn)所用主要軟件
[0050] UNIFI 1. 6. I :UPLC/MS/MS 數(shù)據(jù)采集及濃度計(jì)算。
[0051] 4、檢測(cè)方法
[0052] ((1)建立肝微粒體溫孵體系，加入內(nèi)標(biāo)物和系列濃度的1-羥基咪達(dá)唑侖對(duì)照品， 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品；
[0053] (2)將標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)條件如下：
[0054] 色譜柱：ACQUITY UPLC-BEH C18, 1. 7 μ m, 2. I X 50mm(Waters 公司）
[0055] 流動(dòng)相：A :0.1 %甲酸水溶液
[0056] B :0· I %甲酸乙腈溶液
[0057] 流速： 0· 3mL/min
[0058] 柱溫： 40 Γ
[0059] 進(jìn)樣盤(pán)溫度：4°C
[0060] 離子源： 電噴霧離子化源（ESI);
[0061] 內(nèi)標(biāo)（IS) :50ng/mL鄰甲苯海拉明乙腈溶液
[0062] 梯度洗脫：
[0063]
[0064] 進(jìn)樣量? Q.2^L .運(yùn)行財(cái)間.:； 3 min 保留時(shí)間： iR(MDZ) =1.50min; /R,jS) ~ 1.57min 細(xì)貸 I LU k (Capillary voltage): 3,OOkV 尚卞源溫^ (Source Tenipcraturc): 150 °C J:-溶劑化溫丨 ?: (Desolvation Temperature): 350 °C 去溶劑化氣體流速（Desolvation gas flow): 650 L/h 錐孔氣體流速（Cone gas flow): 150 L/h 審化 '' ? I、'.力（Nebulizer. gas pressure): 6,0 bar 檢測(cè)方式： 正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM) 離十對(duì)： "A.342.08-323.94 (OH-MDZ )，饑々 270. 181.08 (IS) 錐孔電壓（Conevoltage): 14V (OH-MDZ)和 15 V (IS) 碰撞電壓（Collision energy): 20 V (OH-MDZ)和 12V (IS)
[0065] 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得到1-羥基咪達(dá)唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0066] (3)按照步驟（1)相同的方法，將底物咪達(dá)唑侖與肝微粒體溫孵體系共溫孵 20min，制備得到含有內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)樣品，將待測(cè)樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，按照步 驟⑵相同的條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)樣品中的1-羥基咪達(dá)唑侖濃度。
[0067] 在確定本發(fā)明的檢測(cè)方法各項(xiàng)工藝參數(shù)中，發(fā)明人對(duì)本發(fā)明方法的色譜條件和質(zhì) 譜條件進(jìn)行了篩選，結(jié)果如圖1-4所示。
[0068] 圖1為母離子和錐孔電壓的優(yōu)選結(jié)果。
[0069] 三種離子對(duì)的檢測(cè)結(jié)果如下：
[0070] ⑴圖2的質(zhì)譜條件為：
[0071] 離子對(duì)：m/z 342. 08 -m/z 323. 94,錐孔電壓14V，碰撞電壓20V，也即本發(fā)明的質(zhì) 譜條件。
[0072] 結(jié)果顯示強(qiáng)度為4032227。
[0073] (2)圖3的質(zhì)譜條件為：
[0074] 離子對(duì)：m/z 342. 08 - m/z 203. 04,錐孔電壓