一種小分子有機(jī)物修飾生物傳感元件的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物傳感元件修飾領(lǐng)域，具體涉及一種小分子有機(jī)物直接修飾生物傳感元件的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物傳感元件是生物傳感器的核心部件。生物傳感器由于其具有靈敏度高、生物特異性強(qiáng)；操作簡(jiǎn)單，測(cè)量速度快；可以對(duì)生物反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)；整機(jī)可以小型化等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)研究、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物戰(zhàn)劑探測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。所有生物傳感器面臨的最為關(guān)鍵、最為復(fù)雜的步驟就是需要在生物傳感元件表面固定生物識(shí)別分子，從而制備敏感功能膜。傳感敏感功能膜的制備方法包括物理吸附法和共價(jià)鍵法等。物理吸附法是將抗體等生物識(shí)別分子固定到傳感元件上最簡(jiǎn)單的方法，缺點(diǎn)是修飾的生物識(shí)別分子量少且易脫落以及生物識(shí)別分子不定向吸附導(dǎo)致活性損失。共價(jià)鍵法是采用化學(xué)鍵合的方式將抗體、DNA等生物識(shí)別分子修飾到傳感元件上，優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合比較牢固、再生性能良好，缺點(diǎn)是生物分子活性會(huì)因化學(xué)鍵合而降低，同樣地，生物識(shí)別分子不定向修飾到傳感器會(huì)使得活性損失，降低傳感器的靈敏度。當(dāng)有機(jī)污染物分子量較小時(shí)(如〈1000)，直接將該物質(zhì)固定在傳感器表面非常困難。當(dāng)采用固定生物識(shí)別分子(如抗體等)時(shí)，由于再生條件往往比較苛刻，對(duì)其活性影響很大，最終影響生物傳感分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。
[0003]如何在小分子風(fēng)險(xiǎn)污染物上引入合適的功能基團(tuán)并將其組裝到生物傳感元件表面，制備出生物識(shí)別分子活性高、均勻性與一致性好、載量大、非特異性吸附弱、再生性能好的生物傳感元件敏感功能膜至關(guān)重要。目前，制備小分子有機(jī)物的生物傳感元件大多是將小分子物質(zhì)偶聯(lián)在惰性蛋白上，形成包被抗原，再修飾到生物傳感元件表面，但是該種方法，過(guò)程繁瑣，且不能保證生物傳感元件的長(zhǎng)期使用，使用期限有限，因此，如何將小分子化合物直接固定到探頭表面已經(jīng)成為表面修飾領(lǐng)域中的一個(gè)研究難點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種小分子有機(jī)物修飾生物傳感元件的方法。
[0005]本發(fā)明所提供的方法，包括如下步驟:
[0006]I)表面羥基化的生物傳感元件的硅烷化:將表面羥基化的生物傳感元件浸漬于硅烷化試劑中反應(yīng)，得到硅烷化后的生物傳感元件，其中，所述硅烷化試劑為帶氨基的硅烷化試劑；
[0007]2)硅烷化后的生物傳感元件表面連接雙功能基團(tuán):將硅烷化后的生物傳感元件浸漬于N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)和N，N- 二異丙基乙胺(DIEA)的甲苯溶液中反應(yīng)，得到表面連接雙功能基團(tuán)的生物傳感元件；
[0008]3)連接雙功能基團(tuán)的生物傳感元件表面連接高分子聚合物:將表面連接雙功能基團(tuán)的生物傳感元件浸漬于聚醚酰亞胺(PEI)的水溶液中進(jìn)行反應(yīng)，得到表面連接高分子聚合物的生物傳感元件；
[0009]4)連接高分子聚合物的生物傳感元件表面連接小分子有機(jī)物:在1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)存在下，將表面連接高分子聚合物的生物傳感元件和帶有羧基的小分子有機(jī)物進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到表面修飾有小分子有機(jī)物的生物傳感元件。
[0010]上述方法中，步驟I)中，所述表面羥基化的生物傳感元件是通過(guò)如下方法制備得到:將生物傳感元件浸漬于Piranha溶液中，得到表面輕基化的生物傳感元件，
[0011]其中，所述生物傳感元件具體可為生物芯片或光纖傳感器，所述生物芯片可為石英玻璃片，所述光纖傳感器可為石英光纖。
[0012]所述Piranha溶液為濃硫酸和雙氧水按體積比3:1混合后得到的混合物。
[0013]所述浸漬的溫度為20?30°C，時(shí)間為20?40min。
[0014]步驟I)中，還包括對(duì)所述表面羥基化的生物傳感元件進(jìn)行如下處理的步驟:將其于去離子水中超聲洗滌，直至超聲洗滌后所得溶液的pH為中性，最后，于室溫下，用氮?dú)獯蹈?，保存于真空干燥箱中備用?br>[0015]上述方法中，步驟I)中，所述帶氨基的硅烷化試劑具體可為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTS)，所述(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷是以無(wú)水甲苯溶液的形式存在，所述(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的無(wú)水甲苯溶液中(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的體積分?jǐn)?shù)為I?5%。該硅烷化試劑帶氨基，可使得光纖傳感器帶活性基團(tuán)氨基，用于后續(xù)的生物分子固定。
[0016]所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為20-30°C，具體可為室溫(25°C )，反應(yīng)時(shí)間為0.5_2h，具體可為lh。
[0017]步驟I)中，還包括對(duì)所述硅烷化后的生物傳感元件進(jìn)行如下處理:對(duì)其用無(wú)水甲苯溶液進(jìn)行清洗，充分去除反應(yīng)副產(chǎn)物，并用氮?dú)獯蹈?，再?50-250°C下烘烤10-60min，具體可在200 °C下烘烤60min。
[0018]上述方法中，步驟2)中，所述N，K -二琥珀酰亞胺基碳酸酯和N，N-二異丙基乙胺的甲苯溶液中N，f - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯的濃度為(0.005-0.015) mg/ml ；N, N- 二異丙基乙胺的體積分?jǐn)?shù)為3-3.5%，具體可為3.3%。
[0019]所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為20_30°C，反應(yīng)時(shí)間為I?3h。
[0020]上述方法中，步驟3)中，所述聚醚酰亞胺的平均分子量為5000?15000。
[0021 ] 所述聚醚酰亞胺的水溶液中聚醚酰亞胺的體積分?jǐn)?shù)為2?5 %。
[0022]所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為20_30°C，反應(yīng)時(shí)間為0.5-1.5h。
[0023]上述方法中，步驟4)中，所述帶有羧基的小分子有機(jī)物具體可為雙酚酸(該物質(zhì)分子式中既含有一個(gè)羧基，同時(shí)又含有雙酚A的結(jié)構(gòu))
[0024]所述縮合反應(yīng)的反應(yīng)溫度為20_30°C，反應(yīng)時(shí)間為10?15h。
[0025]所述縮合反應(yīng)具體可按如下步驟進(jìn)行:將NHS、EDC和雙酚酸溶于水中，得到混合液，再將連接高分子聚合物的生物傳感元件浸漬于所述混合液中進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到表面修飾有小分子有機(jī)物的生物傳感元件，
[0026]其中，NHS、EDC和雙酚酸的質(zhì)量比為(8-12):(8-12):1。
[0027]所述縮合反應(yīng)的反應(yīng)溫度為20_30°C，反應(yīng)時(shí)間為10?15h。
[0028]通過(guò)縮合反應(yīng)將所述連接高分子聚合物的生物傳感元件表面的氨基和小分子有機(jī)物上的羧基反應(yīng)，脫水縮合形成酰胺鍵，將需要修飾的小分子有機(jī)物直接以共價(jià)鍵的形式連接在生物傳感元件表面。所述EDC/NHS可用于活化表面帶有羧基的小分子有機(jī)物。
[0029]本發(fā)明所制備得到的表面修飾有小分子有機(jī)物的生物傳感元件也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030]本發(fā)明利用高分子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)富含氨基，能夠?yàn)樯锓肿踊蛐》肿优浠墓潭ㄌ峁┏渥愕慕Y(jié)合位點(diǎn)等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了小分子有機(jī)物直接固定到生物傳感元件表面，本發(fā)明方法修飾的傳感元件由于小分子有機(jī)物能定向排列，形成完美的單分子結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)致密，其小分子有機(jī)物本身不會(huì)對(duì)蛋白產(chǎn)生吸附，因此不會(huì)產(chǎn)生非特異性吸附。同時(shí)，小分子有機(jī)物在傳感元件表面能夠形成一層保護(hù)膜，阻斷蛋白與底層硅烷化試劑的接觸，則這種傳感元件的非特異性吸附性質(zhì)完全不受硅烷化試劑的影響。聚乙烯亞胺(PEI)對(duì)蛋白質(zhì)的吸附很弱，所以由其修飾的基片也對(duì)蛋白吸附亦很弱，當(dāng)?shù)鞍椎臐舛群艿蜁r(shí)，非特異性吸附可以忽略。
【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為實(shí)施例1和實(shí)施例2中生物傳感元件表面修飾過(guò)程示意圖。
[0032]圖2為實(shí)施例3中光纖傳感器的特異性反應(yīng)和非特異性吸附的信號(hào)響應(yīng)曲線(xiàn)。
[0033]圖3為實(shí)施例4中生物芯片的特異性反應(yīng)和非特異性吸附的響應(yīng)信號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0035]下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0036]實(shí)施例1、將小分子化合物4，4-雙(4-羥苯基)戊酸(亦稱(chēng)雙酚酸)直接固定在光纖傳感器表面:
[0037]按圖1所示的生物傳感元件表面修飾過(guò)程示意圖進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):
[0038]I)光纖傳感器是利用購(gòu)買(mǎi)的芯徑為600 μm，數(shù)值孔徑為0.22的石英光纖制備而成。具體制備方法如下:將石英光纖截成3cm的光纖段，然后將長(zhǎng)為3cm的光纖段的光纖包層去除，放入氫氟酸中腐蝕5min后，用清水清洗干凈，得到光纖傳感器，即可用于生物分子的固定；
[0039]2)用Piranha溶液(濃H2SO4=H 202 =體積比為3:1)于25°C下清洗光纖傳感器表面30min，用于去除其表面的有機(jī)物，并使其表面羥基化；然后再將其放入超聲波清洗儀中洗滌，并用超純水進(jìn)行充分清洗，直到清洗液的PH值為中性，最后在室溫下用氮?dú)獯蹈?，保存于真空干燥箱中備用?br>[0040]3)將清潔干凈的表面羥基化的光纖傳感器放入體積分?jǐn)?shù)為2% (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTS)的無(wú)水甲苯溶液中，于25°C下反應(yīng)lh，再用甲苯溶液進(jìn)行多次沖洗，充分去除反應(yīng)副產(chǎn)物，氮?dú)獯蹈桑?00°C下烘烤Ih ;通過(guò)硅烷化作用，將硅烷基引入到表面羥基化的光纖傳感器表面；
[0041]4)在硅烷化后的光纖傳感器表面連接雙功能基團(tuán)，具體步驟如下:將1.5mgN1Nr - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)和5mL N, N- 二異丙基乙胺(DIEA)溶于145mL無(wú)水甲苯中，并將硅烷化后的光纖傳感器放入其中，于25°C下反應(yīng)2h，之后，取出并用甲苯?jīng)_洗干凈；DSC可與硅烷化試劑上的氨基反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生NHS-酯基團(tuán)，可偶聯(lián)高分子聚合物上的氨基，得到連有雙功能基團(tuán)的光纖傳感器；
[0042]5)將連有雙功能基團(tuán)的光纖傳感器放入具有多氨基的分子量為10000的聚醚酰亞胺(PEI)的水溶液中(其體積分?jǐn)?shù)為2%，可通過(guò)超純水配制)，于25°C下反應(yīng)lh，用超純水清洗數(shù)次，得到表面連有高分子聚合物的光纖傳感器；
[0043]6)利用EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)將連有高分子聚合物的光纖傳感器表面的氨基和小分子化合物上的羧基偶聯(lián)，從而使得小分子化合物直接固定于光纖傳感器表面，用于小分子有機(jī)物的免疫分析，具體方法如下:在ImL濃度為10mg/mL的NHS水溶液中加入10 μ L濃度為Img/ μ L EDC水溶液，混合均勻后，加入ImL濃度為lmg/mL的雙酚酸水溶液，將連有高分子聚合物的光纖傳感器放入其中，于25°C下反應(yīng)12h，超純水沖洗數(shù)次，氮?dú)?