一種基于聚苯乙烯乳膠的癌癥標(biāo)志物免疫層析試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種基于聚苯乙烯乳膠的癌癥標(biāo)志物免疫層析試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，健康問(wèn)題越來(lái)越備受人們的關(guān)注，而癌癥已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康和生命，所以對(duì)癌癥的診斷提出了更多的要求。目前對(duì)癌癥的診斷主要是傳統(tǒng)診斷方法包括影像診斷(X射線，B超，CT和核磁共振等)，化學(xué)診斷(生化檢驗(yàn)，血液檢驗(yàn)等)以及細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)診斷等。后兩種的診斷主要是對(duì)癌癥標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，癌癥標(biāo)志物就是癌癥患者體內(nèi)癌細(xì)胞在增殖，生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移等過(guò)程中產(chǎn)生和釋放的某些物質(zhì)，多以抗原、激素等形式存在于寄主血液或者癌細(xì)胞中，所以現(xiàn)在癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)對(duì)癌癥的診斷有很大的實(shí)用價(jià)值。癌癥標(biāo)志物主要有甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異抗原(PSA)以及一些糖類抗原等。目前檢測(cè)癌癥標(biāo)志物的方法主要有:放射免疫測(cè)定，酶標(biāo)電泳法，化學(xué)發(fā)光法以及ELISA法等，這些方法存在著檢測(cè)靈敏度不高，價(jià)格昂貴和耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。市場(chǎng)上現(xiàn)在快速檢測(cè)癌癥標(biāo)志物的基于膠體金的金標(biāo)試紙法，檢測(cè)快速、靈敏度高，但是也存在不穩(wěn)定，全血檢測(cè)抗干擾能力差，成本較高等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于聚苯乙烯乳膠的癌癥標(biāo)志物免疫層析試劑盒。
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒的使用方法。
[0005]技術(shù)方案:為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種基于聚苯乙烯乳膠的癌癥標(biāo)志物免疫層析試劑盒，試劑盒包括試紙條、干燥劑和吸管，試紙條底部為塑料底襯板，樣品玻璃纖維膜、免疫結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次粘貼在塑料底襯板上。
[0006]其中，所述塑料底襯板上相鄰粘貼物之間相互重疊部分長(zhǎng)度為2mm。
[0007]其中，所述試紙條干燥封裝，保存在溫度4°C?常溫條件下。
[0008]—種基于聚苯乙烯乳膠的癌癥標(biāo)志物免疫層析試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0009](I)聚苯乙烯乳膠微球的前處理
[0010]所用聚苯乙烯乳膠微球原始質(zhì)量濃度為1% (即聚苯乙烯占乳膠微球的質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，直徑200?500nm，表面為羧基修飾；
[0011]取10 μ L乳膠微球，加入90 μ L 2_ (N-嗎啉)乙磺酸緩沖液(即MES緩沖液，1mM,pH 6.0)稀釋10倍；
[0012]取100 μ L稀釋好的濃度為0.1 %的乳膠微球，加入2?4mg 1_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽(EDC)和2?4mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)來(lái)活化微球表面修飾的羧基，混合溶解后置于避光處I?2h ;
[0013]在8000?9000rpm條件下離心5?lOmin，棄上清液并用MES緩沖液(10?20mM，pH 6.0)洗滌3次去掉多余的活化劑，最后用磷酸緩沖液(10?20mM，pH 7.4)重懸至lmL，保存待用；
[0014](2)乳膠-抗體結(jié)合物的制備
[0015]在ImL前處理好的聚苯乙烯乳膠微球中加入3?5 μ L I μ g/mL的癌癥標(biāo)志物標(biāo)記抗體，室溫振蕩反應(yīng)Ih;
[0016]將反應(yīng)后的溶液在8000?9000rpm條件下離心5?lOmin，棄上清液并用磷酸緩沖液(10?20mM，pH 7.4)洗滌3次，最后用10?15%牛血清白蛋白溶液重懸至lmL，保存待用；
[0017](3)目標(biāo)物免疫結(jié)合墊的制備
[0018]將制好的乳膠-抗體結(jié)合物噴涂到玻璃纖維膜上，得到目標(biāo)物免疫結(jié)合墊；
[0019](4)具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜(NC膜)的制備
[0020]在一條硝酸纖維素膜上噴涂上lmg/mL的癌癥標(biāo)志物包被抗體和羊抗鼠二抗，其中癌癥標(biāo)志物包被抗體作為檢測(cè)線，羊抗鼠二抗作為質(zhì)控線；
[0021](5)基于聚苯乙烯乳膠的癌癥標(biāo)志物免疫層析試紙條的制備
[0022]將樣品玻璃纖維膜、免疫結(jié)合墊、具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維膜和吸水墊四種粘貼物分別依次粘貼到塑料底襯板上，并且相鄰粘貼物之間相互重疊部分長(zhǎng)度為2mm，得到基于聚苯乙烯乳膠的癌癥標(biāo)志物免疫層析試紙條，干燥封裝，保存于溫度4°C?常溫條件下。
[0023]其中，所述癌癥標(biāo)志物為甲胎蛋白，癌胚抗原或前列腺特異抗原，癌癥標(biāo)志物的標(biāo)記抗體與包被抗體也為上述標(biāo)志物對(duì)應(yīng)的標(biāo)記抗體與包被抗體。
[0024]有益效果:本發(fā)明與傳統(tǒng)技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0025]1、本發(fā)明提供了一種基于聚苯乙烯乳膠的癌癥標(biāo)志物免疫層析試劑盒，能夠快速檢測(cè)出血液中的癌癥標(biāo)志物，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏度高，無(wú)需任何儀器輔助；
[0026]2、本發(fā)明所用聚苯乙烯乳膠相比于傳統(tǒng)試紙所用的膠體金，降低了生產(chǎn)成本，并且提高了全血檢測(cè)的穩(wěn)定性，解決了血液非特異性吸附干擾膠體金顯色造成的假陽(yáng)性；
[0027]3、本發(fā)明為通用型免疫層析試紙條，只要將所用的抗體進(jìn)行替換即可檢測(cè)其他目標(biāo)物；
[0028]4、本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高，抗干擾強(qiáng)，易于推廣應(yīng)用，適用于醫(yī)院、檢驗(yàn)檢疫以及家庭等需要現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的場(chǎng)所。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為本發(fā)明試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為樣品玻璃纖維素膜、2為免疫結(jié)合墊、3為硝酸纖維素膜、4為檢測(cè)線、5為質(zhì)控線、6為吸水墊以及7為塑料底襯板；
[0030]圖2為本發(fā)明正面檢測(cè)結(jié)果判定示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1:
[0032]—種基于聚苯乙烯乳膠的甲胎蛋白免疫層析試劑盒的制備方法具體操作步驟如下:
[0033](I)聚苯乙烯乳膠微球的前處理
[0034]所用聚苯乙烯乳膠微球原始質(zhì)量濃度為I %，直徑300nm，表面為羧基修飾；
[0035]取10 μ L乳膠微球，加入90 μ L 2_ (N-嗎啉)乙磺酸緩沖液(MES緩沖液，1mM, pH6.0)稀釋10倍；
[0036]取10yL稀釋好的濃度為0.1 %的乳膠微球，加入2mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽(EDC)和2mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)來(lái)活化微球表面修飾的羧基，混合溶解后置于避光處Ih ;
[0037]在9000rpm條件下離心5min，棄上清液并用MES緩沖液(10mM，pH 6.0)洗滌3次去掉多余的活化劑，最后用磷酸緩沖液(PBS，10mM，pH 7.4)重懸至lmL，保存待用。
[0038](2)乳膠-抗體結(jié)合物的制備
[0039]在ImL前處理好的聚苯乙稀乳膠微球中加入3 μ L I μ g/mL的甲胎蛋白標(biāo)記抗體，室溫振湯反應(yīng)Ih ；
[0040]將反應(yīng)后的溶液在9000rpm條件下離心5min，棄上清液并用磷酸緩沖液(PBS，1mM, pH 7.4)洗滌3次，最后用10%牛血清白蛋白溶液(BSA)重懸至原體積，保存待用。
[0041](3)目標(biāo)物免疫結(jié)合墊的制備
[0042]將制好的乳膠-抗體結(jié)合物噴涂到玻璃纖維膜上，得到目標(biāo)物免疫結(jié)合墊。
[0043](4)具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜(NC膜)的制備
[0044]在一條硝酸纖維素膜上噴涂上lmg/mL的甲胎蛋白包被抗體和羊抗鼠二抗，其中甲胎蛋白包被抗體作為檢測(cè)線，羊抗鼠二抗作為質(zhì)控線。
[0045](5)基于聚苯乙烯乳膠的甲胎蛋白免疫層析試紙條的制備
[0046]將樣品玻璃纖維膜、免疫結(jié)合墊、具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維膜和吸水墊四種粘貼物分別依次粘貼到塑料底襯板上，并且相鄰粘貼物之間相互重疊部分長(zhǎng)度為2mm，得到基于聚苯乙烯乳膠的甲胎蛋白免疫層析試紙條，干燥封裝，保存于溫度4°C?常溫條件下。
[0047]實(shí)施例2
[0048]—種基于聚苯乙烯乳膠的癌胚抗原免疫層析試劑盒的制備方法具體操作步驟如下:
[0049](I)聚苯乙烯乳膠微球的前處理
[0050]所用聚苯乙烯乳膠微球原始質(zhì)量濃度為I %，直徑300nm，表面為羧基修飾；取10 μ L乳膠微球，加入90 μ L 2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液(MES緩沖液，1mM, pH 6.0)稀釋10倍；
[0051]取10yL稀釋好的濃度為0.1 %的乳膠微球，加入3mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽(EDC)和4mg N-羥基琥珀酰亞胺(