牛布魯氏菌膠體金抗體檢測(cè)試紙條的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種牛布魯氏菌抗體診斷方法--牛布魯氏菌膠體金抗體 檢測(cè)試紙條，屬生物制品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 布魯氏菌?。ú疾。┦怯刹剪斒暇蚍Q(chēng)布魯氏菌（Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā) 熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重地威脅著人和多種動(dòng)物的生命健康。本病不但對(duì)動(dòng)物的繁殖 和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴(yán)重 的公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此在布魯氏菌流行的國(guó)家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計(jì)劃中最重要的 目標(biāo)之一。
[0003] 布病在世界存在已有久遠(yuǎn)的歷史，人類(lèi)對(duì)該病的研究認(rèn)識(shí)逐步加深，診斷水平不 斷提高，隨著動(dòng)物布病的研究進(jìn)展，動(dòng)物布病血清學(xué)的檢測(cè)方法不斷改進(jìn)和提高。傳統(tǒng)的凝 集試驗(yàn)（如：虎紅抗原平板凝集試驗(yàn)、試管抗原凝集試驗(yàn)、乳環(huán)凝集試驗(yàn)）逐漸被敏感性高、 特異性強(qiáng)的ELISA方法、熒光偏振試驗(yàn)（FPA)等新的檢測(cè)技術(shù)所取代。
[0004] 凝集試驗(yàn)是布魯氏菌病診斷的一種常用的方法，包括血清凝集實(shí)驗(yàn)、乳環(huán)沉淀試 驗(yàn)和抗人免疫球蛋白試驗(yàn)，其中經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)（STAT)、平板凝集試驗(yàn)（PAT)，以 上方法在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)基本停止使用，取而代之的是緩沖布魯氏菌抗原凝集試驗(yàn)如虎紅平 板凝集試驗(yàn)（RBPT)。虎紅平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌菌株經(jīng)培養(yǎng)，滅活，離心 收集菌體后用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價(jià)格便宜，操作 方便，檢測(cè)快速，適于動(dòng)物群體布魯氏菌病的普查。在國(guó)際貿(mào)易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢 測(cè)的指定試驗(yàn)，在我國(guó)也用于人布魯氏菌病監(jiān)測(cè)的初篩。乳環(huán)沉淀試驗(yàn)依然是乳牛布魯氏 菌監(jiān)測(cè)的主要方法，該方法直接對(duì)牛乳進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)奶牛群體進(jìn)行篩檢，該方法簡(jiǎn)便快 速。
[0005] 在布魯氏菌病血清學(xué)檢驗(yàn)中一致認(rèn)為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT)在特異性上優(yōu)于其他 方法，常被用來(lái)對(duì)試管凝集試驗(yàn)和虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性或可疑的病例進(jìn)行定性檢 測(cè)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)一直被認(rèn)為是最有效的布病診斷方法，至今尚沒(méi)有一種診斷方法能取代 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)在血清學(xué)診斷中的地位。但補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)所需要的溶血素的制備困難，試驗(yàn) 操作繁瑣，難以在臨床上普遍使用，而且由于豬體內(nèi)的補(bǔ)體會(huì)干擾豚鼠補(bǔ)體的作用，導(dǎo)致敏 感性下降。
[0006] ELISA是一種與CFT效果相當(dāng)?shù)脑\斷方法，該方法操作方便，靈敏度高，特異性較 好，一次可以完成大量樣品的檢測(cè)，既可以作為篩選試驗(yàn)應(yīng)用于動(dòng)物群體檢疫，還可以作為 確診試驗(yàn)。ELISA不僅可以應(yīng)用于血清抗體的檢測(cè)，還可應(yīng)用于乳樣中抗體的檢測(cè)。牛的布 魯氏菌病ELISA檢測(cè)方法已是國(guó)際貿(mào)易中指定的檢測(cè)方法之一，其他種布魯氏菌的ELISA 檢測(cè)方法也是研究的熱點(diǎn)。目前，用于布魯氏菌病檢測(cè)的ELISA有間接ELISA(iELISA)和 競(jìng)爭(zhēng) ELISA (cELISA)兩種。
[0007] 上述各種布病檢測(cè)方法各有其自身的特點(diǎn)，但存在的共同缺陷是以上各種檢驗(yàn)都 必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。一般先分離血清，然后按照各種方法的操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。而 免疫膠體金技術(shù)克服了上述缺陷，可以直接采血后，滴加到膠體金試紙條加樣孔內(nèi)，現(xiàn)場(chǎng)就 能判定是否為布魯氏菌感染。
[0008] 雖然已有相關(guān)膠體金發(fā)明專(zhuān)利的報(bào)道，如中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸 醫(yī)研究所王興龍等、吉林大學(xué)閆廣謀等（【申請(qǐng)?zhí)枴緾N200710055740. 5, CN200710055741.X， CN200810051726. 2)采用以重組的金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA)作為金標(biāo)抗體，由于SPA具 有非特異性吸附IgG分子的能力，因此可用于對(duì)多種不同動(dòng)物進(jìn)行診斷，但對(duì)不同動(dòng)物體 內(nèi)IgG吸附能力各不相同，因此對(duì)采用同一個(gè)試紙條對(duì)不同動(dòng)物進(jìn)行布病檢測(cè)，其敏感性 并不穩(wěn)定。本發(fā)明使用的是針對(duì)牛IgG Fc端的單克隆抗體標(biāo)記膠體金制成膠體金抗體檢 測(cè)試紙條的金膠墊，只用于檢測(cè)牛布魯氏菌，提高了檢測(cè)的敏感性和膠體金檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn) 定性。再如，杭州迪恩科技有限公司張明洲等（【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310033074. 0)，采用布魯氏菌 菌體抗原作為質(zhì)控線(xiàn)包被抗原，再利用一種抗紅細(xì)胞的單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)用的單抗，吸 附干燥的膠體金蛋白（流動(dòng)帶），建立了夾心法檢測(cè)牛布魯氏菌抗原的檢測(cè)試紙卡，一方面 該專(zhuān)利中并未明確闡述其核心技術(shù)特征，另一方面，由于布魯氏菌與一些革蘭氏陰性細(xì)菌， 特別是耶爾森氏菌09和大腸桿菌0157具有較強(qiáng)的菌體抗原相似性，而該專(zhuān)利中使用布魯 氏菌菌體抗原作為膠體金顆粒的吸附抗原，理論上其檢測(cè)結(jié)果會(huì)存在一定的非特異性。
[0009] 本發(fā)明以制備的光滑型布魯氏菌S2株脂多糖（LPS)代替SPA，作為試紙條中測(cè)試 線(xiàn)包被抗原（檢測(cè)帶），提高了檢測(cè)的敏感性；以鼠抗牛IgG Fc端的單克隆抗體標(biāo)記膠體 金制成膠體金抗體檢測(cè)試紙條的金膠墊（流動(dòng)帶），提高了試紙條檢測(cè)的特異性；以羊抗鼠 IgG抗體作為檢測(cè)試紙條的質(zhì)控抗原（質(zhì)控帶），開(kāi)發(fā)建立的牛布魯氏菌膠體金抗體檢測(cè)試 紙條克服了上述發(fā)明專(zhuān)利的不足，使建立的方法具有更好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。
[0010] 本發(fā)明專(zhuān)利具有操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快捷，易于判斷和保存等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)無(wú)需任何儀器 設(shè)備，非常適合臨床快速診斷，特別是基層農(nóng)村和小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的布病檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于改變現(xiàn)有布魯氏菌診斷技術(shù)均需要依靠實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)狀，為我國(guó) 牛布魯氏菌的診斷提供一種方便快捷，并具有良好特異性和敏感性的診斷方法。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0013] 1. -種牛布魯氏菌膠體金抗體檢測(cè)試紙條，該試劑條主要含有：以制備的光滑型 豬種布魯氏菌S2株的脂多糖（LPS)作為測(cè)試線(xiàn)包被抗原（檢測(cè)帶），以鼠抗牛IgG Fc端的 單克隆抗體標(biāo)記膠體金制成膠體金抗體檢測(cè)試紙條的金膠墊（流動(dòng)帶），以羊抗鼠IgG抗體 作為檢測(cè)試紙條的質(zhì)控抗原（質(zhì)控帶），同時(shí)含有試紙條樣品吸收墊（樣品墊）、玻璃纖維 素膜（膠體金墊）、吸水紙；將噴有檢測(cè)線(xiàn)、質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜上端貼上吸水墊，下端貼 上金標(biāo)墊及樣品吸收墊，以上各組分首尾相連，完整銜接，其中：
[0014] (1)該膠體金試紙條中使用的包被抗原LPS來(lái)源于豬種布魯氏菌（S2株），該LPS 對(duì)豬、牛、羊布魯氏菌病的病原菌具有良好的敏感性，提高了試劑盒檢測(cè)的敏感性；
[0015] (2)LPS提取過(guò)程中增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提步驟，提高了 LPS純度，減少 了 LPS中陰雜蛋白含量過(guò)高導(dǎo)致的非特異性反應(yīng)；本試劑盒不僅能有效排除常規(guī)革蘭氏陰 性細(xì)菌對(duì)布魯氏菌的干擾，而且能排除一般布病間接ELISA試劑盒無(wú)法區(qū)分小腸結(jié)腸炎耶 爾森氏菌09和大腸桿菌0157干擾的技術(shù)缺陷，提高了檢測(cè)的特異性；
[0016] (3) LPS的包被量基于對(duì)其純度和質(zhì)量的測(cè)定；
[0017] (4)本發(fā)明利用鼠抗牛IgG Fc端的單克隆抗體標(biāo)記膠體金制成膠體金抗體檢測(cè) 試紙條的金膠墊，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的特異性。
[0018] 2.本發(fā)明所述牛布魯氏菌膠體金抗體檢測(cè)試紙條中LPS抗原的純度測(cè)定方法是：
[0019] 將商品化 LPS 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 lmg/ml、100 μ g/ml、10 μ g/ml、1 μ g/ml、100ng/ml、 lOng/ml等不同稀釋度；同時(shí)根據(jù)稱(chēng)重結(jié)果將LPS配制成lmg/ml的初始濃度，并稀釋成 100 μ g/ml的濃度；將上述各稀釋度的LPS溶液取100 μ 1/樣品加入96孔酶標(biāo)板上，在 529nm波長(zhǎng)下讀取吸光度；建立LPS標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度的0D529值，并建立濃度與吸光度之間 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以及布魯氏菌LPS吸光度，計(jì)算LPS的濃度。LPS純度為：LPS濃 度X單位體積/單位質(zhì)量。
[0020] 3.本發(fā)明所述牛布魯氏菌膠體金試紙條在對(duì)布魯氏菌檢測(cè)時(shí)不需要復(fù)雜的檢測(cè) 儀器，能在采血現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，特別適合牛場(chǎng)養(yǎng)殖人員和基層獸醫(yī)使用。
[0021] 本發(fā)明【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明主要包含以下三個(gè)方面的內(nèi)容：
[0023] 1.檢測(cè)抗原的制備。選取布魯氏菌疫苗S2株作為抗原生產(chǎn)種子，將S2經(jīng)TSA培 養(yǎng)后，提取的LPS，經(jīng)純化和定量后，用于固定于膠體金試紙條的硝酸纖維素膜對(duì)應(yīng)檢測(cè)線(xiàn) 的位置。
[0024] (1)本申請(qǐng)建立了