多種真菌毒素快速聯(lián)合檢測試劑盒及其制備和使用方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及多種真菌毒素快速聯(lián)合檢測試劑盒及其制備和使用方法，屬于食品安全檢測領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】:
真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)毒性和致癌性，能夠污染幾乎所有種類的食用和飼用農(nóng)產(chǎn)品。聯(lián)合國糧農(nóng)組織的數(shù)據(jù)顯示，世界上約有25%的谷物不同程度地受到真菌毒素的污染而不能食用，不僅在經(jīng)濟(jì)上造成了巨大的損失，而且由真菌產(chǎn)生的真菌毒素還能引起人畜中毒，嚴(yán)重時甚至可以致癌。
[0003]一種真菌可以產(chǎn)生多種不同的真菌毒素，不同的真菌可以產(chǎn)生相同的真菌毒素。目前已知能產(chǎn)生真菌毒素的真菌有150余種，產(chǎn)生的真菌毒素約有300種。真菌的生長和繁殖都需要一定的溫濕度條件，最適宜生長溫度一般為20?30°C，霉菌繁殖產(chǎn)毒的最適溫度為25?30°C。其中曲霉菌屬最適宜生長溫度為30°C左右，青霉菌屬為25°C左右，鐮刀菌屬一般為25°C左右。當(dāng)真菌處于干燥低溫或處于與其他真菌競爭的應(yīng)激情況時，就會產(chǎn)生霉菌毒素，由于真菌生長有一定的地域性，因此，不同區(qū)域占優(yōu)勢的真菌毒素種類也不同。由于受氣候、種植方式、貯藏條件和消費(fèi)習(xí)慣等影響，我國農(nóng)產(chǎn)品受真菌毒素污染危害更為嚴(yán)重。真菌毒素防控已成為保障我國乃至世界糧食安全、食品安全和環(huán)境安全的迫切需求。
[0004]嘔吐毒素(簡稱DON即脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)，人畜長期食用低劑量的霉變玉米，毒素會在體內(nèi)沉積，構(gòu)成健康危害。特別是對動物而言，毒素會在動物肌肉組織中有很高含量殘留，而正常烹飪過程不會對毒素有破壞，因此可以通過動物組織對人類健康構(gòu)成危害。現(xiàn)在，社會已經(jīng)注意到藥物殘留帶給人們的危害，而毒素殘留的危害遠(yuǎn)比藥物殘留危害嚴(yán)重得多，卻還沒引起人們足夠的重視。
[0005]赭曲霉毒素A是一種腎臟毒素，并具有致畸、致癌及免疫毒性的真菌毒素。理化性質(zhì)穩(wěn)定，人體攝入后主要導(dǎo)致腎臟病變，是一種慢性進(jìn)行性疾病，往往造成死亡。尸檢癥狀腎臟明顯縮小、腎間質(zhì)纖維化及腎小管變性等，腎盂癌、輸尿管癌于此毒素有關(guān)。
[0006]玉米赤霉烯酮理化性質(zhì)穩(wěn)定，玉米中污染最普遍。它是非固醇類、具有雌性激素性質(zhì)的真菌毒素，主要作用于生殖系統(tǒng)，母豬最敏感，可引起不育癥、流產(chǎn)等。未見引起人類中毒的報道，但與雌性激素相關(guān)的人類疾病可能與該毒素有關(guān)。
[0007]為應(yīng)對真菌毒素的嚴(yán)重危害，100多個國家或地區(qū)制定了相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)，加強(qiáng)殘留的檢測及監(jiān)控，建立有效的殘留檢測方法勢在必行。針對這種情況，急需建立一種快速、簡便的真菌毒素類殘留快速檢測方法。目前真菌毒素的檢測技術(shù)主要有色譜技術(shù)和免疫分析技術(shù)等。色譜技術(shù)為經(jīng)典技術(shù)，主要有高壓液相色譜(HPLC)，液相色譜質(zhì)譜連用(LC-MS)，氣相色譜-質(zhì)譜連用(GC-MS)等，這些方法靈敏準(zhǔn)確，但樣品處理煩瑣費(fèi)時，成本高，而且需要有經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的專業(yè)人員來操作復(fù)雜的儀器設(shè)備。而免疫分析技術(shù)具有敏感、特異、快速的特點(diǎn)，膠體金免疫層析技術(shù)是目前最主要的快速分析方法之一，研制成可以商品化的快速檢測產(chǎn)品，可以準(zhǔn)確檢測出樣品中的真菌毒素，對于食品安全現(xiàn)場檢測、監(jiān)控具有重要的意義。膠體金技術(shù)自上世紀(jì)八十年代應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為POCT的檢測手段，本世紀(jì)初又引入食品安全檢測領(lǐng)域，傳統(tǒng)的膠體金檢測法將膠體金顆粒標(biāo)記到多孔濾膜上制成膠體金墊，再固定在檢測板上制成檢測試紙。但膠體金墊在實(shí)際使用中存在一定弊端，如膠體金墊釋放的速度太慢、硝酸纖維素膜的疏水性會阻礙金標(biāo)液順暢的流動等。此外，糧食、飼料等固體樣品使用前要進(jìn)行樣品前處理，前處理手段的復(fù)雜會影響整體檢測的效率。
[0008]
【發(fā)明內(nèi)容】
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為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的一是在于提供一種簡便、靈敏、價格低廉的嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A三種真菌毒素快速聯(lián)合檢測試劑盒，本發(fā)明目的二是提供使用上述試劑盒的制備方法，本發(fā)明目的三是提供使用上述的試劑盒進(jìn)行嘔吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A毒素檢測的使用方法。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
本發(fā)明提供的嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A三種真菌毒素快速聯(lián)合檢測試劑盒包括檢測試紙和金標(biāo)微孔，所述檢測試紙包括背板上依次粘貼吸液墊、反應(yīng)墊和樣品吸收墊，吸液墊與反應(yīng)墊交疊l~2mm，樣品吸收墊與反應(yīng)墊交疊l~2mm，所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜上包被有I條質(zhì)控線和1~3條檢測線，質(zhì)控線和各條檢測線相互平行，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠多克隆抗體，檢測線包被有嘔吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA中的一種至三種；所述金標(biāo)微孔為0.5~4mg/ml嘔吐毒素單克隆抗體、0.5~4mg/ml玉米赤霉烯酮單克隆抗體、0.5~4mg/ml赭曲霉毒素A單克隆抗體混合膠體金液,包被于微孔板中。吸液墊采用吸水紙制成，所述樣品吸收墊為吸水玻璃纖維素膜與高分子吸水纖維素膜疊加壓制而成。檢測試紙寬度為4~6mm,吸液墊長16~18mm,反應(yīng)墊長15~18mm,樣品吸收墊長18~20mm。質(zhì)控線、1~3條檢測線之間互相間距均為5~6mm。質(zhì)控線由ΡΗ6~8、0.θΓθ.05Μ磷酸緩沖液稀釋至0.rimg/ml羊抗鼠多克隆抗體包被。檢測線由ΡΗ5~8、0.θΓθ.05Μ磷酸鹽緩沖液稀釋至0.l~3mg/ml的嘔吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA偶聯(lián)物包被。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
嘔吐毒素-BSA制備:嘔吐毒素標(biāo)品1~4 mg加50~200μ I 二甲基亞砜，加N，N’-羰基二咪唑10~50 mg，25~45 °〇水浴攪拌；牛血清白蛋白Γ25 mg加100~500 μ I 0.0lM pH4~7 PBS溶解；攪拌反應(yīng)l~4h。
[0011]玉米赤霉烯酮-BSA制備:稱玉米赤霉烯酮標(biāo)品10~30 mg,溶于20~30 ml卩比唆溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)；濃縮至干，加5~10 ml超純水，用NaOH調(diào)pH6~8，用乙酸乙酯萃取三次，棄去有機(jī)層；加HCl使水層pH3-4 ;過濾,加入12~15 mg/ml的二環(huán)己基碳二亞胺的無水DMF溶液0.Γ0.5 ml，室溫振蕩3-5 h ;加入牛血清白蛋白100 mg加10 ml 0.05M pH 8?10碳酸緩沖液。
[0012]赭曲霉毒素-BSA制備:50~100 mg赭曲霉毒素A溶于15~25 mL N, N- 二甲基甲酰胺溶液中后，加到20 mL溶有400 mg BSA的PBS溶液中，合成赭曲霉毒素A-戊二醛-BSA復(fù)合物；在上述混合溶液中逐滴加入150 μ L 25%的戊二醛；將此混合物在室溫下用磁力攪拌機(jī)輕柔攪拌3h ;用0.0lM pH7.3 PBS透析3天，每天換液2次。
[0013]免疫動物:選擇6周齡雌性BALB/C小鼠，將抗原與福氏完全佐劑等量混合、乳化，經(jīng)腹部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫。分別隔4周，進(jìn)行第二、三次免疫。第三次免疫后第7?10天，斷尾取血，分離血清，用ELISA方法檢測血清效價。用生理鹽水稀釋免疫原對高效價小鼠進(jìn)行連續(xù)加強(qiáng)免疫。處死小鼠，浸泡于75%酒精lmin。將小鼠仰臥在解剖板上,剪開胸部皮膚，縱向拉開皮膚，暴露腹部，用注射器抽取5mL無血清培養(yǎng)液注入腹腔，輕柔腹部I?2min，吸出細(xì)胞懸液，移入離心管。用無血清培養(yǎng)液離心洗滌一次。棄去上清液，力口入HAT培養(yǎng)液，均勻懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，0.1mL/孔。置37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)備用。
[0014]細(xì)胞融合:將50% PEG 4000、無血清培養(yǎng)液、HAT篩選培養(yǎng)液置37°C CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱。收獲對數(shù)生長期的Sp2/0細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗滌3次，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)。無菌條件下分離脾細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)。將I X 18脾細(xì)胞與I X 17 Sp2/0細(xì)胞在50mL尖底離心管中混勻，離心棄去上清液。將含有脾細(xì)胞和Sp2/0瘤細(xì)胞的50mL尖底離心管放于水杯中，用ImL吸管吸取0.7mL PEG 4000緩慢加入到細(xì)胞混懸液中，靜置90秒，加15mL 37°C預(yù)熱的無血清培養(yǎng)液，離心棄去上清液，加入37°C預(yù)溫HAT培養(yǎng)液充分混勻。接種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，置37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)。
[0015]雜交瘤細(xì)胞的篩選和雜交瘤細(xì)胞的克隆:融合5天觀察有小集落后